Secuencia de la DNA Nanopore para análisis de metagenómica suelo
Summary
Nanopore technology para secuenciación de biomoléculas tiene amplias aplicaciones en Ciencias de la vida, incluyendo la identificación de patógenos, supervisión de la seguridad del alimento, análisis genomic, metagenomic monitoreo ambiental y caracterización de bacterias resistencia a los antibióticos. En este artículo, el procedimiento de secuenciación de ADN de suelo de metagenómica para identificación de especies utilizando la tecnología de secuenciación nanopore es demostrado.
Abstract
Este artículo describe los pasos para la construcción de una biblioteca de ADN de suelo, preparación y uso de la célula de flujo nanopore y análisis de las secuencias de ADN identificados usando software de computadora. Secuencia de la DNA Nanopore es una técnica flexible que permite la secuenciación del genoma microbiano rápido identificar especies bacterianas y virales, para caracterizar las cepas bacterianas y para detectar las mutaciones genéticas que confieren resistencia a los antibióticos. Las ventajas de nanopore sequencing (NS) para Ciencias de la vida son su baja complejidad, coste reducido y rápida secuencia en tiempo real del ADN genómico purificado, amplicones PCR, las muestras de cDNA o RNA. NS es un ejemplo de “secuencia de filamento”, que consiste en la secuencia DNA guiando una sola molécula de DNA trenzada a través de un nanopore que se inserta en la membrana de un polímero sintético. La membrana tiene una corriente eléctrica aplicada a través de él, por lo que las bases individuales paso a través de la nanopore la corriente eléctrica se interrumpe en diversos grados por las cuatro bases de nucleótidos. La identificación de cada nucleótido se presenta detectando la modulación característica de la corriente eléctrica por las diferentes bases que pasan por el nanopore. El sistema NS consiste en un dispositivo portátil, dispositivo portátil y una celda de flujo desechable que contiene una matriz nanopore alimentado por USB. El dispositivo portátil se conecta a una computadora portátil estándar que lee y graba la secuencia del ADN utilizando el software de computadora.
Introduction
El objetivo de este procedimiento es demostrar los pasos necesarios para la preparación de una biblioteca ambiental de la DNA para la secuenciación, la utilización de un dispositivo de secuencia nanopore flujo celular y realizar análisis de las secuencias de ADN generadas con software de sistema y el centro nacional para las herramientas de Bioinformática de información biotecnológica (NCBI) identificar especies microbianas en el suelo. Actualmente, la mayoría plataformas de secuenciación de ADN requieren una inversión importante en capacitación técnica y de instrumentación compleja, que no es factible en entornos pobres de recursos o en aplicaciones de campo. La plataforma de secuenciación (NS) nanopore elimina estos problemas con un costo efectivo, sencillo de usar protocolo de preparación de biblioteca y un dispositivo portátil secuenciar y analizar una variedad de diferentes tipos de ácidos nucleicos1,3. Hemos incorporado la plataforma NS en varias clases de laboratorio para estudiantes de maestría.
Nanopore tecnología de biomoléculas de secuenciación ha demostrado amplias aplicaciones en Ciencias de la vida, incluyendo la identificación de patógenos bacterianos y virales1,2,6, biodiversidad ambiental estudios, supervisión de la seguridad del alimento, análisis genómico3,5y caracterización de la resistencia bacteriana a los antibióticos4. NS es un método rápido y preciso a los ácidos nucleicos secuencia que se basa en el principio de la “secuencia del filamento” mediante la detección de perturbaciones eléctricas por las bases de nucleótidos individuales cuando la sola DNA trenzada atraviesa un nanopore insertado en un electrificado membrana de polímero sintético. Los pasos involucrados en la preparación de ADN para NS incluyen fragmentación del genoma y reparación final 3′ dA-tailing de fragmentos genómicos, adaptador y correa recocido al ADN, purificación de DNA a biblioteca y cargar la biblioteca en el dispositivo de la célula de flujo nanopore. Fragmentación del genoma en tamaños de 8 kb es logrado por centrifugación a 1-2 μg de ADN genómico a través de un tubo de g de fragmentación. Los extremos genómicos fragmentados luego reparados y cola con dA poli usando un kit disponible comercialmente. Las secuencias solo adaptador trenzado, que son compatibles con la proteína motora nanopore, se agregan a los extremos de ADN que se utilizan para guiar la secuencia de ADN a través de nanopore (figura 1). Las secuencias de anclaje son necesarias para la purificación de ADN y para la localización de las moléculas de ADN a la membrana de poro. La horquilla se genera por la ligadura de un adaptador de horquilla a un extremo de la biblioteca de cola dA. Las estructuras de la horquilla en los extremos de ADN permite la lectura de las hebras sentido y antisentido del ADN paso por nanopore (figura 2). La biblioteca genomic preparada se purifica después de la reacción usando granos de estreptavidina utilizando un campo magnético, seguido por la carga de la muestra en la celda de flujo nanopore para análisis.
El ADN secuenciado se evalúa por la calidad y Lee de la secuencia que es aceptable para el análisis es luego sometido a varias herramientas de bioinformática para identificar microbios. Las secuencias se “traducen” FASTQ de un formato de FAST5. En el formato FASTQ, las secuencias pueden utilizarse luego en el análisis BLAST.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se han generado muchos métodos de secuencia de la generación siguiente y cada uno depende de secuenciación por síntesis pero las plataformas de detección para la identificación de nucleótidos difieren. NS, la adición más reciente al mercado, utiliza un método diferente, que no requiere una reacción de secuenciación o etiquetado como nucleótidos. Este método aprovecha diferencial de carga de nucleótidos ya incorporados su paso a través de un poro electrified. La identificación de cada nucleótido se produce por la modulación de la corriente eléctrica por las diferentes bases a medida que pasan a través de la nanopore. Este sistema multiplexado permite muchos fragmentos de la secuencia a la vez. Mediante la secuenciación de ambos filamentos de la DNA, se aumenta perceptiblemente la exactitud de la secuencia y el software de secuenciación, que puede ser cargado en un ordenador portátil, procesa las señales y proporciona la información de secuencia que puede ser analizada.
Pirosecuenciación, una secuenciación por el método de síntesis (SBS), detección de la específica base incorporada en la plantilla depende el ensayo de luciferasa y la generación de señal quimioluminiscente8. En secuencia de semiconductor de ion, el ion de hidrógeno liberado, que disminuye el pH es detectado por un sensor de ion9. Secuencia en tiempo real a la sola molécula depende el cero modo onda guía (ZMW)10, que se ilumina para la detección de una molécula fluorescente etiquetada para el nucleótido incorporado. SBS utiliza un método único para amplificar el ADN diana que los racimos de secuencias únicas son generados13. Detección de la nucleótido añadido se realiza cuando se registra la fluorescencia de los nucleótidos etiquetados. NS por otro lado tiene la ventaja sobre otros métodos en que requiere recursos técnicos limitados, es portable, produce la larga secuencia de lecturas, no requiere previa amplificación del ADN y puede ser operado a un costo reducido en comparación con otros métodos. Nuestros alumnos encuentran el protocolo preparación de biblioteca más nuevo, rápido sencillo y favorable a una clase de laboratorio de tres horas. Algunos de los problemas que encontramos eran burbujas en la célula de flujo que fueron difíciles de eliminar, requiere potencia de los ordenadores significativo (un terabyte de almacenamiento de información), es la corriente de salida de datos en un archivo de FAST5 y la célula de flujo de la secuencia tiene una vida útil limitada antes de que se deteriora. Además, otras desventajas del Protocolo de secuenciación NS ligadura (protocolo largo) es que requiere varios pasos de preparación de la biblioteca, requiere conocimientos en técnicas de biología molecular y genera fidelidad de secuencia reducida en comparación con algunos metodologías de la secuencia3. Sin embargo, recientes avances con el nuevo kit de preparación de biblioteca rápida requiere sólo 10 minutos para la preparación de la biblioteca y ha demostrado una tasa de error de secuencia de la reducción. El nuevo método de preparación de biblioteca era muy favorable para el uso en una clase de laboratorio.
Hay varios pasos críticos en el protocolo, especialmente en el control de calidad de la célula de flujo. Esto incluye realizar un control de calidad inicial dentro de los cinco días de la recepción de la célula de flujo y utilizando dentro de 8 semanas. Aunque hemos utilizado células de caudalómetro que estaban más allá de 8 semanas, se reduce el número de poros abiertos, activo. Es importante que los experimentos se planean para una línea de tiempo donde se logra la máxima utilización de las células de flujo. Hemos utilizado el protocolo de limpieza y volver a utilizar las células de flujo con éxito.
Investigando la metagenómica del suelo representa un reservorio genético sin explotar de la diversidad microbiana. Por ejemplo, un gramo de suelo se estima contienen entre 107 – 109 células procariotas14. Por otra parte, organismos del suelo son una fuente principal de nuevos productos naturales, enzimas y antibióticos. Así, análisis de la secuencia del DNA de suelo metagenómica representa una valiosa herramienta educacional para los estudiantes en cada nivel de enseñanza. La tecnología de NS facilidad de uso y bajo costo hacer este sistema una herramienta de enseñanza muy eficaz. Los estudiantes pueden secuencia de muestras ambientales y al terminar la secuencia utilice herramientas bioinformáticas disponibles para identificar y caracterizar secuencias de microbios y metagenómica en muestras de prueba. Usando la tecnología de NS, los estudiantes tienen experiencia práctica, que se hasta ahora de alcanzar para el uso en los cursos de laboratorio debido a los avanzados conocimientos técnicos y altos costos de reactivos, equipos y mantenimiento en otras plataformas de secuenciación. Uno de nuestros estudiantes (J. Harrison, comunicación personal) había divulgado recientemente, el uso de esta tecnología en un proyecto de monitoreo ambiental de suelos agrícolas. Esperamos que habrá muchas más aplicaciones de esta tecnología en el espacio de la educación.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto fue apoyo en parte por la Universidad de Johns Hopkins, oficina del Rector a través de la iniciativa científica de puerta de enlace.
Materials
| Thermal Cycler | LifeECO | BTC42096 | |
| Covaris g-TUBE | Covaris | 520079 | |
| NEBNext End Repair Module | New England BioLab | E7546 | |
| Eppendorf LoBind Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | |
| NEB Blunt/TA Ligase Master Mix | New England BioLab | MO367 | |
| MyOne C1 Strepavidin Beads | Thermo Fisher | 65001 | |
| Eppendorf microcentrifuge | Eppendorf | Model 5420 | |
| Nanodrop UV spectrophotometer | Thermo Fisher | ND-2000 | Model 2000 |
| Belly Dancer Orbital Shaker | Sigma-Aldrich | Z768499 | |
| Power Soil DNA Isolation Kit | MO BIO | 12888-50 | |
| Ligation Sequencing Kit 2D | Oxford Nanopore | SQK-LSK208 | |
| Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | |
| End-Prep Reaction Buffer and enzyme mix (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix) | New England BioLab | MO367 | |
| AmPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Basic Starter Pack | Oxford Nanopore | Includes MinION Sequencing Device and Flow Cell | |
| MinKNOW software | Oxford Nanopore | ||
| Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | Includes Running Buffer with Fuel (RBF), Fragmentation Mix (FRM) Rapid Adapter (RAD) Library Lodaing Beads (LLB) |
References
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