Нанопор секвенирования ДНК для анализа почвы метагеномных
Summary
Нанопор технология секвенирования биомолекул имеет широкое применение в области наук о жизни, включая выявление возбудителей, мониторинга продовольственной безопасности, геномного анализа, metagenomic мониторинга окружающей среды и характеристика бактериальных устойчивость к антибиотикам. В этой статье показана процедура метагеномных почвы секвенирования ДНК для идентификации видов, с использованием технологии виртуализации Нанопор.
Abstract
Эта статья описывает шаги для построения библиотеки ДНК от почвы, подготовка и использование ячейки Нанопор потока и анализ последовательностей ДНК, определены с использованием компьютерного программного обеспечения. Секвенирования ДНК Нанопор является гибкий метод, который позволяет для быстрого микробного генома для идентификации видов бактериальных и вирусных, характеризуют бактериальных штаммов и выявить генетические мутации, которые наделяют устойчивость к антибиотикам. Преимущества виртуализации (NS) для наук о жизни Нанопор включают его низкой сложности, снижение стоимости и быстрый режиме реального времени последовательности очищенного геномной ДНК, ПЦР ампликонов, образцы cDNA, или РНК. Значение параметра NS — пример «прядь секвенирование», который включает секвенирования ДНК, направляя одну мель молекулы ДНК через Нанопор, которая вставляется в синтетические полимерные мембраны. Мембрана имеет электрического тока применяется через его, так как отдельные базы проходят через Нанопор электрического тока нарушается в различной степени четырех оснований нуклеотидов. Идентификации Каждый нуклеотид происходит путем обнаружения характерной модуляцией электрического тока от разных базы, как они проходят через Нанопор. NS система состоит из КПК, питание USB портативного устройства и одноразовые потока ячейку, которая содержит массив Нанопор. Переносное устройство подключается к стандартной портативный компьютер, который считывает и записывает последовательность ДНК, с помощью компьютерного программного обеспечения.
Introduction
Целью этой процедуры является продемонстрировать шаги, необходимые для подготовки экологической библиотеки ДНК для виртуализации, использование Нанопор потока клеток последовательности устройства и для выполнения анализа созданных последовательностей ДНК, с помощью системного программного обеспечения и Национальный центр биотехнологии информации (NCBI) Биоинформатика инструменты для определения видов микроорганизмов в почве. В настоящее время большинство платформ секвенирования ДНК требуют крупных инвестиций в техническую подготовку и сложных инструментария, который не является осуществимым в бедных условиях ресурсов или в области приложений. Платформа виртуализации (NS) Нанопор устраняет эти проблемы с экономически эффективной, простой в использовании библиотеки подготовка протокола и портативное устройство последовательности и проанализировать ряд различных видов нуклеиновые кислоты1,3. Мы включили платформы NS в несколько классов лаборатории для магистрантов.
Нанопор технология секвенирования биомолекул продемонстрировала широкое применение в области наук о жизни, включая выявление бактериальных и вирусных патогенов1,2,6, экологические биоразнообразия исследования, мониторинга продовольственной безопасности, геномный анализ3,5и характеристика бактерий к антибиотикам4. Значение параметра NS — быстрый и точный метод для последовательности нуклеиновых кислот, основанный на принципе «прядь секвенирование» путем обнаружения электрическим нарушение отдельных нуклеотидных баз когда один мель ДНК проходит через Нанопор вставляется в электрифицированных синтетические полимерные мембраны. Этапы подготовки ДНК NS включают генома фрагментации, конец ремонт и 3′ dA хвостохранилища геномной фрагментов, адаптер и троса отжига в ДНК, ДНК библиотека очистки и загрузка библиотеки в ячейки устройство Нанопор потока. Фрагментация генома в ~ 8 КБ размеров достигается путем центрифугирования 1-2 мкг геномной ДНК через g-труба фрагментации. Фрагментированные геномной концы затем отремонтировать и хвост с поли да использование коммерчески доступных комплект. Один адаптер мель последовательностей, которые совместимы с Нанопор двигательные белки, добавляются к концам ДНК, которые используются для руководства последовательности ДНК через Нанопор (рис. 1). Троса последовательности требуются для очистки дна и для локализации молекул ДНК в поры мембраны. Шпилька генерируется безлигатурные шпилька адаптер к одному концу да хвостатых библиотеки. Шпилька структур на концах ДНК позволяет чтение смысл и antisense нити ДНК проходит через Нанопор (рис. 2). Затем подготовленный геномная библиотека очищается от реакции с помощью стрептавидина бусины с помощью магнитного поля, а затем загрузив Образец в ячейку Нанопор потока для анализа.
Последовательности ДНК оценивается качество и последовательность чтений, которые приемлемы для анализа затем подвергаются несколько инструментов биоинформатики для идентификации микробов. Последовательности «переведены» на FASTQ в формате FAST5. В FASTQ формате последовательности затем может использоваться в анализе взрыва.
Protocol
Representative Results
Discussion
Были созданы многие следующего поколения методы секвенирования и каждый зависит от последовательности путем синтеза, но обнаружения платформ для выявления нуклеотидов различаются. NS, самое последнее дополнение к marketplace, использует другой метод полностью, которая не требует реакции последовательности или маркированы нуклеотидов. Этот метод использует заряда дифференциальных уже включены нуклеотидов как они проходят через электрифицированных поры. Идентификации Каждый нуклеотид происходит путем модуляции электрического тока различных баз, как они проходят через Нанопор. Эта мультиплексной системы позволяет пользователю последовательности много фрагментов одновременно. Секвенирование обе нити ДНК, значительно увеличивается точность последовательности и виртуализации программного обеспечения, которое может быть загружена на портативный компьютер, обрабатывает сигналы и предоставляет сведения о последовательности, могут быть проанализированы.
В пиросеквенирования, секвенирование методом синтеза (SBS), выявление конкретных базы, включены в шаблон зависит Люцифераза пробирного и поколения хемилюминесцентный сигнал8. В ионная полупроводник последовательности, выпущенные ионов водорода, что снижает рН обнаружен датчик ионного9. Одной молекулы в реальном времени последовательности зависит от нулевой режим волны руководство (ЦМВ)10, который освещает для обнаружения флуоресцентными молекулы с тегами включены нуклеотидов. SBS использует уникальный метод для того чтобы усилить дна цели таковы, что кластеры уникальных последовательностей сгенерированный13. Обнаружение добавленные нуклеотида достигается, когда записывается флуоресценции тегами нуклеотидов. С другой стороны NS имеет уникальное преимущество перед другими методами, в том, что он требует ограниченные технические ресурсы, портативный, производит длинные последовательности читает, требует без предварительного амплификации ДНК и может эксплуатироваться по сниженной цене по сравнению с другими методами. Наши студенты нашли новые, быстрый библиотека приготовительная протокол быть простым и поддаются класс лаборатории три часа. Некоторые из вопросов, которыми мы столкнулись были пузыри в ячейке потока, которые трудно удалить, она требует значительной вычислительной мощности (один терабайт хранения), токовый выход данных находится в файле FAST5 и последовательности потока клетка имеет ограниченный срок годности до его ухудшается. Кроме того другие недостатки последовательности с NS перевязки (длинный протокол) является что требует несколько шагов подготовки Библиотека, требует опыта в методы молекулярной биологии и генерирует снижение последовательности верности по сравнению с некоторыми секвенирование методологии3. Однако последние достижения в комплект новых быстрого библиотека подготовки требует только 10 минут для приготовления библиотека и продемонстрировал снижение последовательности ошибок. Метод подготовки новой библиотеки был очень подходит для использования в классе лаборатории.
Существует несколько важных шагов в протоколе, особенно в КК потока ячейки. Это включает в себя выполнение первоначальные КК в течение пяти дней с момента получения потока ячейки и их использование в течение 8 недель. Хотя мы использовали потока клетки, которые были за 8 недель, значительно снижается количество открытых активный поры. Важно, что эксперименты планируется подходят временную шкалу, где достигается максимальное использование потока клеток. Мы использовали очистки протокол и повторно потока клетки с успехом.
Расследование метагеномики почвы представляют неиспользованные генетических резервуар микробного разнообразия. Например, предполагается, что один грамм почвы содержат между 107 – 109 прокариотических клеток14. Кроме того почвенные организмы являются основным источником Роман натуральных продуктов, ферментов и антибиотиков. Таким образом анализ последовательности ДНК метагеномики почвы представляет собой ценную учебные инструмент для студентов на всех уровнях образования. NS технологии простота использования и низкая стоимость делают эту систему очень эффективного учебного пособия. Студенты могут последовательность проб окружающей среды и по завершении последовательности использовать имеющиеся Биоинформатика инструменты для выявления и характеристики микробов и метагеномики последовательностей в испытательных образцов. Используя технологию NS, студенты имеют истинной практический опыт, который имеет до теперь из достичь для использования в лабораторных курсов благодаря передовой технический опыт и высокие издержки реагента, оборудование и техническое обслуживание в других платформах виртуализации. Недавно один из наших студентов (J. Харрисон, личного общения) сообщили об использовании этой технологии в проекте экологического мониторинга сельскохозяйственных почвах. Мы ожидаем, что там будет много больше приложений для этой технологии в образовательном пространстве.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект был поддержки в части, Университет Джона Хопкинса, Канцелярии Благочинный через шлюз научная инициатива.
Materials
| Thermal Cycler | LifeECO | BTC42096 | |
| Covaris g-TUBE | Covaris | 520079 | |
| NEBNext End Repair Module | New England BioLab | E7546 | |
| Eppendorf LoBind Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | |
| NEB Blunt/TA Ligase Master Mix | New England BioLab | MO367 | |
| MyOne C1 Strepavidin Beads | Thermo Fisher | 65001 | |
| Eppendorf microcentrifuge | Eppendorf | Model 5420 | |
| Nanodrop UV spectrophotometer | Thermo Fisher | ND-2000 | Model 2000 |
| Belly Dancer Orbital Shaker | Sigma-Aldrich | Z768499 | |
| Power Soil DNA Isolation Kit | MO BIO | 12888-50 | |
| Ligation Sequencing Kit 2D | Oxford Nanopore | SQK-LSK208 | |
| Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | |
| End-Prep Reaction Buffer and enzyme mix (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix) | New England BioLab | MO367 | |
| AmPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Basic Starter Pack | Oxford Nanopore | Includes MinION Sequencing Device and Flow Cell | |
| MinKNOW software | Oxford Nanopore | ||
| Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | Includes Running Buffer with Fuel (RBF), Fragmentation Mix (FRM) Rapid Adapter (RAD) Library Lodaing Beads (LLB) |
References
- Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).
- Greninger, A. L., et al. Rapid metagenomics identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis. Genome Med. 7, 99 (2015).
- Quick, J., et al. Rapid draft sequencing and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella. Genome Biology. 16, 114 (2015).
- Ashton, P. M., et al. MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of a bacterial antibiotic resistance island. Nat Biotechnol. 33, 296-300 (2015).
- Loman, N. J., Quick, J., Simpson, J. T. A complete bacterial genome assembled de novo. using only nanopore sequencing data. Nat Method. 12, 733-735 (2015).
- Hoenen, T., et al. Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Outbreak Tool. Emerg Infect Dis. 22 (2), 331-334 (2016).
- Petrosino, J. F., Highlander, S., Luna, R. A., Gibbs, R. A., Versalovic, J. Metagenomic pyrosequencing and microbial identification. Clin Chem. 55 (5), 856-866 (2009).
- Cummings, P. J., Ahmed, R., Durocher, J. A., Jessen, A., Vardi, T., Obom, K. M. Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization. J. Vis. Exp. (78), e50405 (2013).
- Rothberg, J. W., et al. An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing. Nature. 475, 348-352 (2011).
- Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations. Science. 299, 682-686 (2003).
- Eid, J., et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323, 133-138 (2009).
- Stoddart, D., Heron, A. J., Mikhailova, E., Maglia, G., Bayley, H. Single-nucleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with a biological nanopore. PNAS. 106, 7702-7707 (2009).
- Shendure, J., Hanlee, J. Next generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
- Daniel, R. The Metagenomics of Soil. Nat Rev Microbiol. 3, 470-478 (2005).
