Sequenciamento de DNA Nanopore para análise de solo Metagenomic
Summary
Nanopore tecnologia de sequenciamento biomoléculas tem amplas aplicações nas ciências da vida, incluindo a identificação de patógenos, monitorização da segurança dos alimentos, análise genômica, monitoramento ambiental metagenomic e caracterização de bactérias resistência aos antibióticos. Neste artigo, o processo de sequenciamento de DNA de solo metagenomic para identificação de espécies, usando a tecnologia de sequenciamento de nanopore é demonstrado.
Abstract
Este artigo descreve as etapas para a construção de uma biblioteca de DNA do solo, preparação e uso da célula de fluxo de nanopore e a análise das sequências de DNA identificado usando software de computador. Sequenciamento de DNA de Nanopore é uma técnica flexível que permite o sequenciamento de genoma microbiano rápido identificar espécies bacterianas e virais, para caracterizar as cepas bacterianas e para detectar mutações genéticas que conferem resistência a antibióticos. As vantagens da nanopore (NS) de sequenciamento para Ciências da vida incluem sua baixa complexidade, custo reduzido e rápida em tempo real sequenciamento de DNA genômico purificado, PCR amplicons, amostras de cDNA ou RNA. NS é um exemplo de “sequenciamento da vertente” que envolve o sequenciamento DNA, orientando uma única molécula de DNA encalhada por meio de um nanopore que é inserido em uma membrana de polímero sintético. A membrana tem uma corrente elétrica aplicada através dele, assim como as bases individuais passam a nanopore a corrente elétrica é interrompida em diferentes graus pelos quatro nucleótidos. A identificação de cada nucleotídeo ocorre através da detecção da modulação característica da corrente elétrica por diferentes bases como passam através do nanopore. O sistema de NS consiste de um portátil, USB powered dispositivo portátil e uma célula de fluxo descartáveis que contém uma matriz de nanopore. O dispositivo portátil conecta a um computador portátil padrão que lê e grava a sequência de DNA usando software de computador.
Introduction
O objetivo deste procedimento é para demonstrar as etapas necessárias para a preparação de uma biblioteca de DNA ambiental para sequenciamento, utilização de um dispositivo de sequenciamento de célula de fluxo nanopore e realizar a análise das sequências DNA geradas usando o software de sistema e Centro Nacional de ferramentas de Bioinformática Biotechnology Information (NCBI) para identificar a espécie microbiana no solo. Atualmente, a maioria das plataformas de sequenciamento de DNA requerem um grande investimento em formação técnica e instrumentação complexa, que não é viável em ambientes pobres de recursos ou em aplicações de campo. A plataforma de sequenciamento (NS) nanopore elimina estas questões com um custo-eficaz, simples de usar protocolo de preparação de biblioteca e um dispositivo portátil para sequenciar e analisar uma variedade de diferentes tipos de ácidos nucleicos1,3. Nós incorporamos a plataforma de NS para várias classes de laboratório para alunos de mestrado.
Nanopore tecnologia de sequenciamento biomoléculas demonstrou aplicações largas nas ciências da vida, incluindo a identificação de patógenos bacterianos e virais1,2,6, biodiversidade ambiental estudos, monitorização da segurança dos alimentos, análise genômica3,5e caracterização da resistência antibiótica bacteriana4. NS é um método rápido e preciso de ácidos nucleicos de sequência que é baseado no princípio da “vertente sequenciamento” detectando perturbações eléctricas de nucleótidos individuais quando solteiro encalhado DNA passa por uma nanopore inserido uma eletrificado membrana de polímero sintético. As etapas envolvidas na preparação de DNA para NS incluem a fragmentação do genoma, reparação final e 3′ dA-tailing de fragmentos genômicos, adaptador e baraço recozimento ao DNA, DNA Biblioteca purificação e carregar a biblioteca para o dispositivo de célula de fluxo nanopore. Fragmentação do genoma em tamanhos ~ 8 kb é realizada por 1-2 µ g de DNA genômico através de um tubo de fragmentação g-tubo de centrifugação. As extremidades genomic fragmentadas são reparadas e caudas com dA poli usando um kit disponível comercialmente. Sequências de adaptador único encalhado, que são compatíveis com a proteína de motor nanopore, são adicionadas às extremidades do DNA que são usadas para orientar a sequência de DNA através do nanopore (Figura 1). As sequências de baraço são necessárias para a purificação de DNA e para localizando as moléculas de DNA para a membrana dos poros. O grampo é gerado por ligar um adaptador de gancho para uma extremidade da cauda dA biblioteca. As estruturas de gancho nas extremidades do DNA permite a leitura das fibras sentido e antisentido como o DNA passa a nanopore (Figura 2). A biblioteca genômica preparada é então purificada da reação usando streptavidin grânulos usando um campo magnético, seguido por carregar a amostra dentro da célula de fluxo de nanopore para análise.
O DNA sequenciado é avaliado pela qualidade e leituras de sequenciamento que são aceitáveis para análise são sujeito a várias ferramentas de Bioinformática para identificar os micróbios. As sequências são “convertidas” em um FASTQ de um formato de FAST5. No formato FASTQ, as sequências podem ser usadas na análise de explosão.
Protocol
Representative Results
Discussion
Muitos métodos de sequenciamento de geração seguinte foram gerados e cada um depende de sequenciamento por síntese mas as plataformas de deteção para a identificação de nucleotídeos diferem. NS, a mais recente adição ao mercado, usa um método diferente inteiramente, que não exige uma reação de sequenciamento ou rotulados de nucleotídeos. Este método aproveita-se de diferenciais de carga de nucleotídeos já incorporados como eles passam através de um poro eletrificado. A identificação de cada nucleotídeo ocorre pela modulação da corrente elétrica por diferentes bases como passam através do nanopore. Este sistema multiplexado permite ao usuário sequenciar muitos fragmentos de cada vez. Por sequenciamento ambos os filamentos do DNA, a precisão da sequência é significativamente maior e o software de sequenciamento, o que pode ser carregado em um computador portátil, processa os sinais e fornece as informações de sequência que podem ser analisadas.
Em pyrosequencing, um sequenciamento pelo método de síntese (SBS), deteção da base específica incorporada o modelo varia de acordo com o ensaio do luciferase e a geração de sinais quimioluminescente8. No sequenciamento do semicondutor de íon, o íon de hidrogênio liberado, que diminui o pH é detectado por um sensor de íon9. Sequenciamento em tempo real única molécula depende o zero modo onda guia (ZMW)10, que se acende para a deteção de uma molécula fluorescente etiquetada para o nucleotídeo incorporado. SBS utiliza um método exclusivo para amplificar o DNA alvo tal que clusters de sequências únicas são gerados13. Detecção do nucleotide adicionado é obtida quando a fluorescência do nucleotide etiquetado é gravada. NS por outro lado tem a única vantagem sobre outros métodos em que requer recursos técnicos limitados, é portátil, produz o tempo sequenciamento leituras, requer sem prévia amplificação de DNA e pode ser operado a um custo reduzido em comparação com outros métodos. Nossos alunos encontraram o protocolo de preparação de biblioteca nova, rápida para ser simples e passível de uma classe de laboratório de três horas. Alguns dos problemas que encontramos eram bolhas na célula de fluxo que eram difíceis de remover, é necessário poder significativos do computador (um terabyte de armazenamento), a corrente de saída de dados está em um arquivo de FAST5 e a célula de fluxo de sequenciamento tem uma vida útil limitada antes se deteriora. Além disso, outras desvantagens da ligadura NS sequenciamento (protocolo longo) é que requer várias etapas de preparação de biblioteca, requer conhecimentos em técnicas de biologia molecular e gera fidelidade sequenciamento reduzido quando comparado a alguns metodologias de sequenciamento3. No entanto, recentes avanços com o novo kit de preparação rápida biblioteca requer apenas 10 min para a preparação de biblioteca e demonstrou uma taxa de erro de sequenciamento reduzida. O novo método de preparação de biblioteca foi muito favorável para uso em uma classe de laboratório.
Existem vários passos críticos no protocolo, nomeadamente o QC da célula de fluxo. Isso inclui realizando um QC inicial no prazo de cinco dias a contar da recepção da célula de fluxo e usá-los no prazo de 8 semanas. Embora nós usamos células de fluxo que eram além de 8 semanas, o número de poros aberto/ativo é muito reduzido. É importante que as experiências são planejadas para encaixar uma linha do tempo onde a utilização máxima das células de fluxo é alcançada. Nós temos usado o protocolo de limpeza e reutilizado as células de fluxo com sucesso.
Investigando a metagenômica de representam solo um reservatório genético inexplorado da diversidade microbiana. Por exemplo, um grama de solo é estimado para conter entre 107 – 109 células procarióticas14. Além disso, os organismos do solo são a principal fonte de novos produtos naturais, enzimas e antibióticos. Análise de sequência de DNA do solo metagenomics representa, assim, uma valiosa ferramenta instrucional para estudantes em todos os níveis da educação. A tecnologia NS facilidade de uso e baixo custo fazem deste sistema uma ferramenta muito eficaz de ensino. Os alunos podem de sequência de amostras ambientais e após a conclusão da sequência de usar ferramentas de Bioinformática disponíveis para identificar e caracterizar os micróbios e metagenômica sequências em amostras do teste. Usando a tecnologia NS, os alunos têm a verdadeira experiência hands-on, que tem até agora sido de alcance para utilização em cursos de laboratório por causa da perícia técnica avançada e custos elevados de reagente, equipamentos e manutenção em outras plataformas de sequenciamento. Recentemente, um dos nossos alunos (J. Harrison, comunicação pessoal) relatou o uso desta tecnologia em um projeto de monitoramento ambiental de solos agrícolas. Esperamos que haverá muitas mais aplicações para esta tecnologia na área de educação.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projeto foi apoio em parte pela Universidade Johns Hopkins, gabinete do reitor através da Gateway ciência iniciativa.
Materials
| Thermal Cycler | LifeECO | BTC42096 | |
| Covaris g-TUBE | Covaris | 520079 | |
| NEBNext End Repair Module | New England BioLab | E7546 | |
| Eppendorf LoBind Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | |
| NEB Blunt/TA Ligase Master Mix | New England BioLab | MO367 | |
| MyOne C1 Strepavidin Beads | Thermo Fisher | 65001 | |
| Eppendorf microcentrifuge | Eppendorf | Model 5420 | |
| Nanodrop UV spectrophotometer | Thermo Fisher | ND-2000 | Model 2000 |
| Belly Dancer Orbital Shaker | Sigma-Aldrich | Z768499 | |
| Power Soil DNA Isolation Kit | MO BIO | 12888-50 | |
| Ligation Sequencing Kit 2D | Oxford Nanopore | SQK-LSK208 | |
| Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | |
| End-Prep Reaction Buffer and enzyme mix (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix) | New England BioLab | MO367 | |
| AmPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Basic Starter Pack | Oxford Nanopore | Includes MinION Sequencing Device and Flow Cell | |
| MinKNOW software | Oxford Nanopore | ||
| Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | Includes Running Buffer with Fuel (RBF), Fragmentation Mix (FRM) Rapid Adapter (RAD) Library Lodaing Beads (LLB) |
References
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