Sequenziamento del DNA nanoporo per analisi Metagenomica del suolo
Summary
NanoPore tecnologia per sequenziamento biomolecole ha numerose applicazioni nelle scienze della vita, compresa l’identificazione di agenti patogeni, monitoraggio della sicurezza alimentare, analisi genomica, metagenomici monitoraggio ambientale e caratterizzazione di batteri resistenza agli antibiotici. In questo articolo, la procedura per il sequenziamento del DNA di metagenomica del suolo per l’identificazione di specie utilizzando la tecnologia di sequenziamento nanopore è dimostrata.
Abstract
In questo articolo vengono descritti i passaggi per la costruzione di una libreria di DNA dal suolo, preparazione e utilizzo di cella di flusso nanoporo e l’analisi delle sequenze del DNA identificato utilizzando software per computer. Sequenziamento del DNA nanopore è una tecnica flessibile che permette il sequenziamento del genoma microbico rapido identificare le specie batteriche e virali, per la caratterizzazione di ceppi batterici e per rilevare le mutazioni genetiche che conferiscono resistenza agli antibiotici. I vantaggi di nanopore sequenziamento (NS) per le scienze biologiche includono la bassa complessità, costi ridotti e in tempo reale rapido sequenziamento del DNA genomico purificato, ampliconi PCR, campioni di cDNA o RNA. NS è un esempio di “sequenziamento strand”, che coinvolge il sequenziamento DNA, guidando una singola molecola di DNA incagliata attraverso una nanopore che viene inserita in una membrana di polimero sintetico. La membrana ha una corrente elettrica applicata attraverso di esso, così come le basi individuali passano attraverso il nanoporo la corrente elettrica è interrotta a vari gradi di quattro basi nucleotidiche. L’identificazione di ogni nucleotide si verifica rilevando la caratteristica modulazione della corrente elettrica dalle basi differenti, che passano attraverso il nanoporo. Il NS sistema consiste di un palmare, alimentato via USB dispositivo portatile e una cella di flusso monouso che contiene una matrice di nanopore. Il dispositivo portatile si inserisce in un computer portatile standard che legge e registra la sequenza di DNA mediante software per computer.
Introduction
L’obiettivo di questa procedura è per illustrare i passaggi necessari per la preparazione di una libreria di DNA ambientale per la sequenziazione, l’utilizzo di un dispositivo di sequenziamento nanopore flusso delle cellule e di eseguire analisi delle sequenze del DNA generate utilizzando il software di sistema e Centro nazionale per gli strumenti di bioinformatica Biotechnology Information (NCBI) per identificare la specie microbica nel suolo. Attualmente, la maggior parte delle piattaforme di sequenziamento del DNA richiedono un investimento importante nella formazione tecnica e strumentazione complessa, che non è fattibile in ambienti poveri di risorse o in applicazioni sul campo. La piattaforma di sequenziamento (NS) nanopore elimina questi problemi con un costo conveniente, semplice da utilizzare il protocollo di preparazione di biblioteca e un dispositivo portatile per sequenza e analizzare una varietà di diversi tipi di acidi nucleici1,3. Abbiamo incorporato la piattaforma di NS in diversi corsi di laboratorio per gli studenti di laurea magistrale.
NanoPore tecnologia per sequenziamento biomolecole ha dimostrato ampie applicazioni nelle scienze della vita, compresa l’identificazione di patogeni batterici e virali1,2,6, biodiversità ambientale studi, monitoraggio della sicurezza alimentare, analisi genomic3,5e caratterizzazione di batteri antibiotico-resistenza4. NS è un metodo veloce e preciso per gli acidi nucleici di sequenza che si basa sul principio del “filo di sequenziamento” rilevando perturbazioni elettriche di basi nucleotidiche individuali quando DNA a singola elica passa attraverso una nanopore inserita electrified membrana polimerica sintetica. I passaggi coinvolti nella preparazione di DNA per NS includono frammentazione del genoma, fine riparazione e 3′ dA-tailing di frammenti genomic, adattatore e ricottura di legare al DNA, DNA biblioteca purificazione e caricamento della libreria nel dispositivo di cella di flusso nanopore. Frammentazione del genoma in ~ 8 kb di dimensioni avviene mediante centrifugazione 1-2 µ g di DNA genomic attraverso un tubo di frammentazione del g-tubo. Le estremità genomiche frammentate sono poi riparate e dalla coda con dA poli utilizzando un kit disponibile in commercio. Sequenze di singolo adattatore non recuperabili, che sono compatibili con la proteina motore nanoporo, vengono aggiunti alle estremità del DNA che sono usate per guidare la sequenza di DNA attraverso il nanoporo (Figura 1). Le sequenze di tether sono necessari per purificazione del DNA e per localizzare le molecole di DNA alla membrana poro. Il tornante viene generato legando un adattatore tornante a un’estremità della coda dA biblioteca. Le strutture di tornante alle estremità del DNA permette la lettura dei filamenti senso e antisenso come il DNA passa attraverso il nanoporo (Figura 2). La libreria genomica preparata viene quindi purificata dalla reazione utilizzando streptavidina perline usando un campo magnetico, in seguito caricando il campione nella cella di flusso nanoporo per l’analisi.
Il DNA di sequenza è valutato per la qualità e letture di sequenziamento che sono accettabili per l’analisi sono quindi sottoposti a diversi strumenti di bioinformatica per identificare i microbi. Le sequenze sono “tradotti” in un FASTQ da un formato di FAST5. Nel formato FASTQ, le sequenze possono essere utilizzato quindi nell’analisi BLAST.
Protocol
Representative Results
Discussion
Molti metodi di sequenziamento di generazione successiva sono stati generati e ognuno dipende dal sequenziamento di sintesi ma le piattaforme di rilevamento per l’identificazione dei nucleotidi differiscono. NS, la più recente aggiunta al marketplace, utilizza un metodo diverso completamente, che non richiede una reazione di sequenziamento o etichettati nucleotidi. Questo metodo si avvale del differenziale di costo di nucleotidi già incorporati che passano attraverso un poro elettrificato. L’identificazione di ogni nucleotide si verifica da una modulazione della corrente elettrica dalle basi diverse che passano attraverso il nanoporo. Questo sistema multiplex consente all’utente di molti frammenti di sequenza in un momento. Sequenziando entrambi i filamenti del DNA, la precisione della sequenza è aumentata significativamente e il software di sequencing, che possa essere caricato su un computer portatile, elabora i segnali e fornisce le informazioni di sequenza che possono essere analizzate.
Nel pyrosequencing, una sequenza di metodo di sintesi (SBS), rilevamento della base specifica incorporata nel modello dipende l’analisi di luciferase e la generazione di segnali chemiluminescente8. Nel sequenziamento di semiconduttore di ioni, gli ioni di idrogeno liberato, che fa diminuire il pH viene rilevato da un sensore di ioni9. Sequenziamento in tempo reale di singola molecola dipende la zero modalità onda guida (ZWD)10, che si illumina per il rilevamento di una molecola fluorescente contrassegnata per il nucleotide incorporato. SBS utilizza un metodo unico per amplificare il DNA dell’obiettivo tale che sono aggregati di sequenze uniche generato13. Rilevamento del nucleotide aggiunto si ottiene quando viene registrata la fluorescenza del nucleotide taggato. NS ha d’altra parte il vantaggio unico rispetto ad altri metodi in quanto richiede risorse tecniche limitate, è portatile, produce lunghe letture di sequenziamento, non richiede nessuna previa amplificazione di DNA e può essere azionato a costi ridotti rispetto ad altri metodi. I nostri studenti hanno trovato il protocollo di preparazione più recente, rapido libreria per essere semplice e suscettibili di una classe di laboratorio di tre ore. Alcuni dei problemi che abbiamo incontrato erano bolle nella cella di flusso che erano difficili da rimuovere, ha richiesto la potenza del computer significativo (un terabyte di spazio di archiviazione), la corrente di uscita dei dati è in un file di FAST5 e la cella di flusso di sequenziamento ha una durata limitata prima di esso si deteriora. Inoltre, altri svantaggi del NS legatura sequenziamento protocollo (protocollo lungo) è che richiede diversi passaggi di preparazione di biblioteca, richiede competenze nelle tecniche di biologia molecolare e genera la fedeltà di sequenziamento ridotta rispetto ad alcuni metodologie di sequenziamento3. Tuttavia, recenti progressi con il nuovo kit di preparazione rapida libreria richiede solo 10 minuti per la preparazione di biblioteca e ha dimostrato un tasso di errore ridotto sequenziamento. Il nuovo metodo di preparazione di biblioteca era molto favorevole per l’uso in una classe di laboratorio.
Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo, in particolare in QC di cella di flusso. Questo include l’esecuzione di un controllo di qualità iniziale entro cinque giorni dal ricevimento della cella di flusso e il loro utilizzo entro 8 settimane. Anche se abbiamo usato le cellule di flusso sono stati oltre 8 settimane, il numero di pori aperti/attivo è notevolmente ridotto. È importante che gli esperimenti sono programmati per un diario dove si ottiene il massimo utilizzo di celle di flusso. Abbiamo utilizzato il protocollo di pulizia e riutilizzato le cellule di flusso con successo.
Studiando la metagenomica del rappresentano terreno un serbatoio genetico non sfruttato della diversità microbica. Ad esempio, un grammo di suolo si stima che contenga tra 107 – 109 cellule procariotiche14. Inoltre, gli organismi del terreno sono la principale fonte di nuovi prodotti naturali, enzimi e antibiotici. Così, analisi di sequenza del DNA Metagenomica del suolo rappresenta un prezioso strumento didattico per studenti di ogni livello di istruzione. La tecnologia di NS facilità d’uso e basso costo rendono questo sistema uno strumento didattico molto efficace. Gli studenti possono campioni ambientali di sequenza e al completamento della sequenza di utilizzare strumenti di bioinformatica disponibili per identificare e caratterizzare i microbi e metagenomica sequenze in campioni di prova. Utilizzando la tecnologia di NS, gli studenti hanno vera esperienza hands-on, che ha fino ad ora stato di raggiungere per uso nei corsi di laboratorio a causa delle competenze tecniche avanzate e alti costi di reagente, attrezzature e manutenzione in altre piattaforme di sequenziamento. Recentemente, uno dei nostri studenti (J. Harrison, comunicazione personale) ha riferito l’uso di questa tecnologia in un progetto di monitoraggio ambientale dei suoli di fattoria. Ci aspettiamo che ci saranno molte altre applicazioni per questa tecnologia nello spazio di formazione.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto è stato di supporto in parte dalla Johns Hopkins University, ufficio del preposto attraverso il Gateway Science Initiative.
Materials
| Thermal Cycler | LifeECO | BTC42096 | |
| Covaris g-TUBE | Covaris | 520079 | |
| NEBNext End Repair Module | New England BioLab | E7546 | |
| Eppendorf LoBind Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | |
| NEB Blunt/TA Ligase Master Mix | New England BioLab | MO367 | |
| MyOne C1 Strepavidin Beads | Thermo Fisher | 65001 | |
| Eppendorf microcentrifuge | Eppendorf | Model 5420 | |
| Nanodrop UV spectrophotometer | Thermo Fisher | ND-2000 | Model 2000 |
| Belly Dancer Orbital Shaker | Sigma-Aldrich | Z768499 | |
| Power Soil DNA Isolation Kit | MO BIO | 12888-50 | |
| Ligation Sequencing Kit 2D | Oxford Nanopore | SQK-LSK208 | |
| Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | |
| End-Prep Reaction Buffer and enzyme mix (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix) | New England BioLab | MO367 | |
| AmPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Basic Starter Pack | Oxford Nanopore | Includes MinION Sequencing Device and Flow Cell | |
| MinKNOW software | Oxford Nanopore | ||
| Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | Includes Running Buffer with Fuel (RBF), Fragmentation Mix (FRM) Rapid Adapter (RAD) Library Lodaing Beads (LLB) |
References
- Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).
- Greninger, A. L., et al. Rapid metagenomics identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis. Genome Med. 7, 99 (2015).
- Quick, J., et al. Rapid draft sequencing and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella. Genome Biology. 16, 114 (2015).
- Ashton, P. M., et al. MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of a bacterial antibiotic resistance island. Nat Biotechnol. 33, 296-300 (2015).
- Loman, N. J., Quick, J., Simpson, J. T. A complete bacterial genome assembled de novo. using only nanopore sequencing data. Nat Method. 12, 733-735 (2015).
- Hoenen, T., et al. Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Outbreak Tool. Emerg Infect Dis. 22 (2), 331-334 (2016).
- Petrosino, J. F., Highlander, S., Luna, R. A., Gibbs, R. A., Versalovic, J. Metagenomic pyrosequencing and microbial identification. Clin Chem. 55 (5), 856-866 (2009).
- Cummings, P. J., Ahmed, R., Durocher, J. A., Jessen, A., Vardi, T., Obom, K. M. Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization. J. Vis. Exp. (78), e50405 (2013).
- Rothberg, J. W., et al. An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing. Nature. 475, 348-352 (2011).
- Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations. Science. 299, 682-686 (2003).
- Eid, J., et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323, 133-138 (2009).
- Stoddart, D., Heron, A. J., Mikhailova, E., Maglia, G., Bayley, H. Single-nucleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with a biological nanopore. PNAS. 106, 7702-7707 (2009).
- Shendure, J., Hanlee, J. Next generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
- Daniel, R. The Metagenomics of Soil. Nat Rev Microbiol. 3, 470-478 (2005).
