Nanopore רצפי DNA לניתוח Metagenomic אדמה

הערה: ה-DNA Metagenomic מטוהר מן האדמה (במחוז בולטימור, מרילנד) באמצעות בידוד גנומית של קרקע זמינים מסחרית קיט (ראה טבלה של חומרים). שימוש ספקטרופוטומטרים UV (ראה טבלה של חומרים), ה-DNA גנומי מטוהרים צריך להיות יחס (ננומטר) 260/280 > 1.8 ו- 260/230 יחס בין 2.0-2.2 להבטיח כי המדגם הינו ללא מזהמים. כמות ה-DNA גנומי הדרושות NS נע בין 200 ng כדי 2 µg. 1. שיטת הכנה מהירה ספריה (פרוטוקול קצר) הערה: הוא זה פרוטוקול קצר. ראה טבלה של חומרים עבור ערכת רצף מהיר. ב- mL 0.2 צינור דק עם קירות (ראה טבלה של חומרים) להוסיף 200 ng של משקל מולקולרי גבוה ה-DNA הגמר נפח של 7.5 µL של מים מזוקקים. להוסיף 2.5 µL של פיצול מיקס (FM) ערכת הכנה מהירה לספריה, לערבב בעדינות על-ידי היפוך. הדופק צנטריפוגה ספין למטה (1,000 x g עבור 5 s). הכנס את הדגימה thermocycler (ראה טבלה של חומרים) עבור סיבוב אחד ב 30 ° C עבור 1 דקות ולאחריה 75 ° C עבור מינימלית 1 להסיר לצנטריפוגה צינור ודופק על תוצאה לדגימה. הוסף µL 1 של מתאם מהירה ו- 0.2 µL של בלאנט/ת א ליגאז מיקס מאסטר ולאחר מכן לאחסן בספריה מותאמת, קשור בקרח.הערה: אם באמצעות פרוטוקול קצר והמשך לשלב 8 2. מצדו רצף פרוטוקול (פרוטוקול ארוך): Metagenomic DNA פיצול הערה: ראה טבלה של חומרים עבור ערכת רצף מצדו. למהול 1 µg של דנ א גנומי מטוהרים נפח סופי של 46 µL במים יונים. העברת הדגימה כדי פיצול ה-DNA צינור (ראה טבלה של חומרים), צנטריפוגה עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר ב 8000 g x באמצעות microcentrifuge (ראה טבלה של חומרים) כדי לייצר שברי גנומית ~ 8 kb. ודא כי כל הנוזל עבר לתוך הצינור אוסף. היפוך הצינור פיצול, לחזור צנטריפוגה ולאחר צנטריפוגה עבור 1 דקות לאסוף את הדנ א הגנומי מפוצלים אל החדר התחתון. להעביר את ה-DNA גנומי מפוצלים צינור 1.5 מ ל איגוד נמוך-DNA סטרילי, ולנתח חלק על ג’ל agarose אחוזים נמוכים (0.6%) כדי לאשר פיצול כדי > 30 kb. 3. מפוצלים הדנ א סוף-אופן ההכנה באמצעות 800 ng של דנ א גנומי מפוצלים ב 45 µL של מים יונים, להוסיף תגובה סוף-פרפ ‘ µL 7 ‘ מאגר (ראה טבלה של חומרים), 3 µL אנזימים מיקס (ראה טבלה של חומרים), ו- 5 µL של נוקלאז ללא מים. מיקס על ידי צנטריפוגה היפוך ודופק (1,000 x g עבור 5 s). להעביר מדגם צינור דק עם קירות 0.2 מ”ל, דגירה דוגמת עבור 5 דקות ב- 20 ° C, ואחריו דגירה-65 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. צנטריפוגה הדופק להביא תוכן לתחתית הצינור. העברה מדגם צינור 1.5 מ ל נמוכה-DNA איגוד microcentrifuge. להכין beads מגנטי (ראה טבלה של חומרים). להוסיף 60 µL של חרוזים resuspended התגובה הכנה סוף שלב 3.5, לערבב על-ידי pipetting. דגירה על מערבל מסובב ב 100 סל”ד (ראה טבלה של חומרים) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. דופק centrifuge המדגם הצניפה החרוזים, ולאחר מכן למקם את הדגימה ליד מגנט. פיפטה ברגע החרוזים הם דבקו המגנט, תגובת שיקוע, להשליך. הסר הצינור החרוזים מגנט ושטוף עם 200 µL של אתנול 70% שזה עתה הוכנו על ידי בעדינות pipetting שיהיה המדגם. צנטריפוגה הדופק הצניפה החרוזים ולחזור המגנט. הסר את תגובת שיקוע וזורקים. חזור על השלב כביסה שוב באמצעות µL 200 של 70% אתנול. דופק centrifuge ברכבת התחתית, לחזור המגנט ולהסיר כל בכביסה אתנול 70%. עם המכסה צינור microcentrifuge פתוחה, לאפשר את החרוזים מהאוויר להתייבש במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. להסיר את הצינורית של מגנט, להשעות את צניפה ב µL 31 סטרילי, נטולת נוקלאז מים. תקופת דגירה של 2 דקות בטמפרטורת החדר. להחזיר את הצינור המגנט עד כל החרוזים יש מגורען, eluate ברור. להעביר את eluate צינור microcentrifuge 1.5 mL. שימוש µL 1 מדגם, לכמת את הדנ א. נכין קצה באמצעות ספקטרופוטומטרים UV ב-260 nm (ראה טבלה של חומרים).הערה: אחוז ההחלמה צריך להיות ~ 70% (700 ng) של ריכוז ההתחלתי של µg 1 של הדנ א. 4. מתאם, בנוסף הקשר שברי DNA גנומי מוכנה סוף לערבב את כל ליגאז בלאנט/ת צינורות מיקס מאסטר על ידי היפוך ולאחר מכן דופק צנטריפוגה כדי להביא תוכן התחתון. באמצעות 30 µL של DNA מוכנה סוף, להוסיף 20 µL של מתאם שילוב, µL 50 של בלאנט/ת א מצדו מיקס מאסטר. לערבב על-ידי היפוך, הדופק צנטריפוגה, תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר. 5. מגנטי Bלראש הכנה מערבולת החרוזים, ואז העברת µL 50 של חרוזים על תנאי כדי microfuge 1.5 mL צינור. מניחים את הצינורית על המגנט על גלולה החרוזים עד eluate. הסר את תגובת שיקוע וזורקים. להוסיף 100 µL חרוז איגוד מאגר (ראה טבלה של חומרים עבור ערכת חרוז) החרוזים, מערבולת כדי resuspend את החרוזים, גלולה החרוזים על המגנט, להסיר את תגובת שיקוע ולמחוק. חזור על השטיפה עם 100 µL מחייב המאגר. להוסיף 100 µL חרוז איגוד המאגר החרוזים שטף. מערבולת כדי resuspend את החרוזים. 6. ספריית טיהור שימוש micropipette P200, להוסיף µL 40 של חרוזים מהשלב הקודם גנומית הותאם/קשור לדנ א. מערבבים את הדגימה בקפידה על-ידי pipetting. דגירה המדגם על מערבל מסובב ב 100 סל”ד למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שים המדגם על המגנט ולאפשר את החרוזים להתיישב. פיפטה הנחה תגובת שיקוע וזורקים. Resuspend את החרוזים ב 140 µL חרוז איגוד מאגר על-ידי pipetting. מקם את הדגימות המגנט, למחוק את תגובת שיקוע ולאחר לשטוף שוב עם עוד 140 µL חרוז איגוד מאגר. דופק centrifuge ברכבת התחתית, במקום את הצינורית על המגנט עבור 2 דק. להסיר את המאגר איגוד חרוז נותרת בגדר. 7. • תנאי של ספריה של חרוזי מגנט Resuspend את החרוזים מגנטי ב 15 µL • תנאי מאגר על-ידי pipetting. דגירה המדגם 10 דקות בטמפרטורת החדר. מקום ברכבת התחתית נגד המגנט הצניפה החרוזים.כאשר הפתרון מנקה, להסיר את µL 15 eluate, העברת צינור microfuge 1.5 mL, ולמקם את הדגימה על קרח. לכמת הספרייה באמצעות ספקטרופוטומטרים UV.הערה: אחוז ההחלמה צריך להיות ~ 25% (250 ng) של ריכוז ההתחלתי של µg 1 של הדנ א. 8. החל פקד בניהול/איכות להסיר את התא זרימה אריזה ולצרף את התא זרימה הרצפים נייד, בזמן אמת (ראה טבלה של חומרים). לצרף את הרצפים (sequencer) למחשב באמצעות כבל USB ולהתחיל את התוכנה רצף (ראה טבלה של חומרים). לחץ על “התחבר” התקן דרך התוכנה רצף, בחר “NC_Platform_QC.py” ולאחר לחץ על “התחל”. בקרת איכות (QC) אורכת כ 6-7 דקות כדי להשלים; חפשו ‘ים של ירוק’ (שטחים גדולים של פלט) על הנתונים QC כדי לאשר כי ישנם מספיק נקבוביות פעילה (> 800) עבור רצפי DNA. 9. מתחיל רצף ריצה פתח את התוכנית רצף; תיבת דו-שיח תופיע. בתיבה מזהה לדוגמה, שם את הדגימה. לחץ על התיבה “זרימה Cell ID” והזן את הקוד נמצא על-גבי המדבקה על גג התא זרימה. פותחים את המכסה תא זרימה והחלק ואז את המכסה מדגם ימינה (בכיוון השעון) כך שגלוי הנמל הדגימה. ברגע היציאה פתוח, בדוק בועה קטנה. הסר microliters כמה המאגר כולל את הבועה. בדוק כדי לוודא כי יש מאגר על פני מערך חיישן. להפוך את המאגר לקרקע על ידי ערבוב 480 µL של הפעלת מאגר עם תערובת דלק (RBF-1, ראה את הטבלה של חומרים) (יש להקפיד לערבב ביסודיות הראשון) עם מים ללא נוקלאז µL 520. להוסיף µL 800 המאגר לקרקע הנמל לקרקע. בזהירות הרימו את המכסה “” כדי להפוך אותו לנגיש. לאחר 5 דקות, להוסיף µL 200 נוספים של מאגר לקרקע הנמל לקרקע. 10. טעינת הספריה לפני הכנת המקום בספריה של ריאגנטים הבאים על הקרח: RBF-1 (מתוך ערכת רצף), הותאם ו קשורה ספריה, ספריה טעינת חרוזים (LLB; הערכה רצף). כדי שפופרת צנטרפוגה 0.2 מ”ל, להוסיף µL 25.5 של RBF ו 12 µL של מים נטולי נוקלאז לשמור בטמפרטורת החדר. מערבבים את תואר ראשון במשפטים מאת pipetting שיהיה. להוסיף µL 26.5 של LLB הצינור 0.2 µL. מערבבים את ריאגנטים מאת pipetting שיהיה.הערה: LLB נוטה הסדר מחוץ התערובת. להוסיף µL 11 של הספריה מותאם, קשור הצינור 0.2 µL. לערבב על-ידי היפוך ו ספין על ידי צנטריפוגה דופק. הוסף µL 75 מדגם מהשלב 9.4 ליציאת ה-“” dropwise. ודא כי כל טיפה זורם לתוך הנמל לפני הוספת הבא. בזהירות להחליף את הדגימה המכסה כך bung מזין את היציאה, ולהחליף את המכסה התקן. 11. הפעלת קובץ Script פרוטוקול תוכנה רצף פתח את התפריט הנפתח תחת “בחר תוכנית” ובחר “רצף של 48 שעות.” לחץ על “לבצע” כפתור כדי להפעיל את קובץ ה-script. בדקו את התוצאות של Mux לסרוק דיווח בזרם ההודעות עבור מספר הנקבוביות פעיל ב MUX לסרוק.הערה: מספר זה עשוי להיות שונה מספר הנקבוביות ב- QC לרוץ, הבדל גדול עשוי להצביע על בעיה. אם יש ירידה משמעותית של הנקבוביות פעיל רץ QC, להפעיל מחדש את התוכנה, אם עדיין יש הבדל משמעותי, לאתחל מחדש את המחשב. בדוק טמפרטורת הקירור היא 34 מעלות צלזיוס כפי שדווח על ידי סקריפט תוכנה רצף.הערה: אם הטמפרטורה היא לא ב 34 ° C ואז לא יהיו מספיק נקבוביות פעיל לריצה. בדוק ההיסטוגרמה באורכים קריאה כדי לקבוע אם המרחק רצף הצפוי ומתאימה הנבחנים. סגור את הסוכן בשולחן העבודה באמצעות ‘סגור x.’ להפסיק תוכנת עריכה ברצף על ידי סוגר את אינטרנט GUI. לנתק את המכשיר מהמחשב. 12. ניתוח של ריצה ותוצאות הערה: במהלך רצף ההפעלה, הנתונים ניתן לנטר שימוש בתוכנית “תצוגה ח באמצעות הסוכן של שולחן העבודה. במהלך או לאחר ההפעלה הושלמה, קבצים זמינים ב FAST5 קובץ בפורמט ה ← נתונים קורא ← להעביר תיקיה (ברירת המחדל). אם תיקיה זו פתוחה כאשר רצף פעילה, המחשב עשוי להקפיא. כדי להציג ולטפל רצפים, להוריד “HDFViewer”. כדי להציג את הקבצים רצף, ישירות פתוח HDF הצופה ← פתוח נתונים בתיקיה ← בחר שכל הקבצים סוגי ← בחר c: כונן (ברירת מחדל) ← בבחירת נתונים ← בחר קריאות ← בחר לעבור. בחר את הקובץ FASTQ בתפריט הנפתח השמאלי; קבצים יפתח, ניתן לשמור בפורמט FASTQ.הערה: לצורך הניסוי התלמיד, רצפים של נוקלאוטידים 350 או יותר נבחרו לצורך ניתוח נוסף. פלט הטלפונים הבסיס מאפשר למשתמש למיין רצף פעולות הקריאה בהתאם לגודל. FASTQ קבצים ניתן לנתח באמצעות פיצוץ (NCBI) או תוכניות אחרות ביואינפורמטיקה.