Nanopore DNA-Sequenzierung für metagenomische Bodenanalyse
Summary
Nanopore Technologie für Sequenzierung Biomoleküle hat breite Anwendungen in den Lebenswissenschaften einschließlich der Identifizierung von Krankheitserregern, Lebensmittelüberwachung Sicherheit, Genomanalyse, metagenomic Umweltüberwachung und Charakterisierung von bakteriellen Antibiotika-Resistenz. In diesem Artikel wird das Verfahren für die metagenomische Boden DNA-Sequenzierung zur Speziesidentifizierung mit Nanopore Sequenzierung Technik demonstriert.
Abstract
Dieser Artikel beschreibt die Schritte zum Aufbau einer DNA-Bibliothek von Boden, Zubereitung und Verwendung der Durchflusszelle Nanopore und Analyse von DNA-Sequenzen identifiziert mittels Computersoftware. Nanopore DNA-Sequenzierung ist eine flexible Technik, die ermöglicht schnelle mikrobielle Genomsequenzierung, bakterieller und viraler Spezies zu identifizieren um Bakterienstämme zu charakterisieren und zu genetische Mutationen zu erkennen, die Resistenz gegenüber Antibiotika verleihen. Nanopore (NS) für Life Sciences-Sequenzierung Vorteile seine geringe Komplexität, reduzierte Kosten und schnelle Echtzeit-Sequenzierung des gereinigten genomischer DNA, PCR-Amplifikate, cDNA Proben oder RNA. NS ist ein Beispiel für “Strang Sequenzierung” einhergehende DNA Sequenzierung durch die Führung von stranded DNA Moleküls durch eine Nanopore, die in eine synthetische Polymermembran eingesetzt wird. Die Membran hat einen elektrischen Strom angewendet über es, so wie die einzelnen Basen durch die Nanopore den elektrischen Strom in unterschiedlichem Maße durch die vier Nukleotidbasen gestört wird. Die Identifizierung der einzelnen Nukleotid erfolgt durch den Nachweis der charakteristischen Modulation des elektrischen Stroms durch die verschiedenen Basen als Durchgang durch die Nanopore. Das NS-System besteht aus einem handheld, Stromversorgung über USB portable Gerät und ein Einweg-Messzelle, die ein Nanopore Array enthält. Das tragbare Gerät steckt in einem standard-Notebook-Computer, der liest und zeichnet die DNA-Sequenz mit Computersoftware.
Introduction
Das Ziel dieses Verfahrens ist für die Vorbereitung einer ökologischen DNA-Bibliothek für die Sequenzierung, Nutzung eines Nanopore Fluß Zelle Sequenzierung Geräts erforderlichen Schritte demonstrieren und die generierte DNA-Sequenzen mit Systemsoftware analysieren und das National Center for Biotechnology Information (NCBI) Bioinformatik, mikrobielle Spezies im Boden zu identifizieren. Derzeit verlangen die meisten DNA-Sequenzierung-Plattformen eine große Investition in technische Schulungen und komplexe Instrumentierungen, was nicht machbar in Ressource armen Umgebungen oder im Feldeinsatz ist. Die Nanopore-Sequenzierung (NS)-Plattform beseitigt diese Probleme mit einer kostengünstigen, einfach zu bedienen, Protokoll Bibliothek Vorbereitung und einem tragbaren Gerät, zu sequenzieren und analysieren eine Vielzahl von verschiedenen Arten von Nukleinsäuren1,3. Wir haben mehrere Labor-Klassen für Master-Studierende die NS-Plattform integriert.
Nanopore Technologie für Sequenzierung Biomoleküle hat breite Anwendungen in den Lebenswissenschaften, einschließlich Ermittlung der bakterielle und virale Erreger1,2,6, ökologischen Biodiversität gezeigt. Studien, Lebensmittel-Sicherheit monitoring, Genomanalyse3,5und Charakterisierung von bakteriellen Resistenz gegen Antibiotika4. NS ist eine schnelle und genaue Methode zur Sequenz Nukleinsäuren, die auf dem Prinzip der basiert “Sequenzierung Strang” durch das Erkennen von elektrischen Störungen durch individuelle Nukleotidbasen wenn einzelne stranded DNA eine Nanopore in einem elektrifizierten eingefügt durchläuft synthetische Polymermembran. Die Schritte bei der Vorbereitung von DNA für NS 3′ dA-Tailing genomische Fragmente, Adapter und Haltegurt Glühen an die DNA, Genom Fragmentierung und Ende Reparatur enthalten DNA Bibliothek Reinigung und die Bibliothek in der Nanopore-Flow-Zelle-Gerät laden. Zersplitterung des Genoms in ~ 8 kb Größe wird durch Zentrifugieren 1-2 µg genomische DNA durch ein g-Tube Fragmentierung Rohr erreicht. Die fragmentierten genomischen Enden sind dann repariert und angebundene mit Poly-dA mit einem kommerziell erhältlichen Kit. Einzelnen gestrandeten Adapter Sequenzen, die kompatibel mit dem Nanopore motor Protein sind, werden hinzugefügt, DNA-enden, die verwendet werden, um die DNA-Sequenz durch die Nanopore (Abbildung 1) zu führen. Der Haltegurt-Sequenzen sind für DNA-Reinigung und zur Lokalisierung der DNA-Moleküle an die Pore Membran erforderlich. Die Haarnadel entsteht durch Ligation einen Haarnadel-Adapter an einem Ende der dA tailed Bibliothek. Die Haarnadel-Strukturen an den Enden der DNA erlaubt das Auslesen der Sense und Antisense Stränge wie die DNA durch die Nanopore (Abbildung 2). Die vorbereitete genomische Bibliothek wird dann aus der Reaktion gereinigt, mit Streptavidin-Perlen mit einem magnetischen Feld, gefolgt von der Probe in die Nanopore Messzelle für die Analyse zu laden.
Die sequenzierte DNA bemisst sich für Qualität und Sequenzierung liest, die akzeptabel für die Analyse sind unterliegen dann mehrere Bioinformatik, Mikroben zu identifizieren. Die Sequenzen sind in einer FASTQ aus einem FAST5 Format “übersetzt”. Im FASTQ-Format können die Sequenzen dann BLAST Analyse genutzt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Viele nächste Generation Sequenzierung Methoden erzeugt wurden und jedes hängt von Sequenzierung durch Synthese aber Erkennung Plattformen zur Identifizierung von Nukleotide unterscheiden. NS, die jüngste Ergänzung zum Marktplatz, verwendet eine andere Methode völlig, die erfordert keiner Sequenzierung Reaktion oder Nukleotide bezeichnet. Diese Methode nutzt kostenlos Differential bereits eingebaute Nukleotide eine elektrifizierte Pore durchschreiten. Die Identifizierung der einzelnen Nukleotid erfolgt durch Modulation des elektrischen Stroms durch die verschiedenen Basen als Durchgang durch die Nanopore. Dieses gebündelte System ermöglicht dem Benutzer viele Fragmente zu einem Zeitpunkt zu sequenzieren. Durch die beiden Stränge der DNA-Sequenzierung, die Genauigkeit der Sequenz wird deutlich erhöht und die Sequenzer-Software, die auf einem Laptopcomputer geladen werden kann, verarbeitet die Signale und die Sequenz informiert, die analysiert werden können.
Detektion der spezifischen Basis in die Vorlage aufgenommen hängt Pyrosequenzierung, eine Abfolge von Synthese (SBS)-Methode, die Luciferase Assay und der Erzeugung von Chemolumineszenz Signale8. In Ion Halbleiter Sequenzierung wird die freigesetzte Wasserstoff-Ionen, die den pH-Wert sinkt durch eine Ionen-Sensor9erkannt. Echtzeit-Sequenzierung Einzelmolekül richtet sich nach der Null Modus Welle Führer (ZMW)10, die für die Erkennung ein fluoreszierendes Molekül markiert, die eingebaute Nukleotid beleuchtet. SBS verwendet eine einzigartige Methode, um die Ziel DNA zu verstärken, so dass einzigartige Sequenzen generierten13sind. Erkennung des zusätzlichen Nukleotids wird erreicht, wenn die Fluoreszenz des tagged Nukleotids aufgezeichnet wird. NS hat auf der anderen Seite einzigartige Vorteil gegenüber anderen Methoden, dass es begrenzte technischen Ressourcen erfordert, tragbar ist, lange Sequenzierung liest produziert, keine vorherige DNA Verstärkung erfordert und zu einem reduzierten Preis im Vergleich zu anderen betrieben werden kann. Unsere Schüler fanden das neuere, schnelle Bibliothek Prep Protokoll, unkompliziert und offen für eine drei-Stunden-Labor-Klasse sein. Einige der Fragen, denen, die wir begegnet, sind Luftblasen in der Messzelle, die schwer zu entfernen waren, es erforderte erhebliche Rechenleistung (ein Terabyte Speicherkapazität) ist die aktuelle Ausgabe von Daten in einer Datei FAST5 und die Sequenzierung Durchflusszelle hat eine begrenzte Haltbarkeit davor verschlechtert sich. Darüber hinaus weitere Nachteile der NS-Ligation Sequenzierung Protokoll (lange) ist, dass es erfordert mehrere Bibliothek Vorbereitungsschritte, erfordert Erfahrung in molekularbiologischen Techniken und reduzierte Sequenzierung Treue im Vergleich zu einigen erzeugt Sequenzierung Methoden3. Jedoch die jüngsten Fortschritte mit der neuen schnellen Bibliothek Vorbereitungssatz erfordert nur 10 min für Bibliothek Vorbereitung und hat eine reduzierte Sequenzierung Fehlerquote unter Beweis gestellt. Die neue Bibliothek Vorbereitung Methode war sehr zugänglich für den Einsatz in einem Labor-Klasse.
Besonders in den QC der Durchflusszelle gibt es mehrere wichtige Schritte in das Protokoll. Dazu gehören Durchführung einer ersten QC innerhalb von fünf Tagen nach Erhalt der Messzelle und mit ihnen innerhalb von 8 Wochen. Obwohl wir Durchflusszellen, die über 8 Wochen waren verwendet haben, ist die Anzahl der Poren öffnen/aktive stark reduziert. Es ist wichtig, dass Experimente geplant sind, um eine Zeitleiste zu passen, wo maximale Nutzung der die Durchflusszellen erreicht. Wir haben die Reinigung Protokoll verwendet und wiederverwendet die Durchflusszellen mit Erfolg.
Untersuchen die Metagenomik der Erde repräsentieren eine ungenutzte genetisches Reservoir der mikrobiellen Diversität. Z. B. ein Gramm Boden wird voraussichtlich zwischen 10 enthalten7 – 109 prokaryotische Zellen14. Bodenorganismen sind darüber hinaus eine Hauptquelle von neuartigen Naturprodukte, Enzyme und Antibiotika. Daher stellt Boden Metagenomik DNA-Sequenzanalyse ein wertvolles Lehrvideos Instrument für Studierende auf allen Ebenen der Bildung. Der NS-Technologie Benutzerfreundlichkeit und niedrige Kosten machen dieses System sehr effektiv Lehrmittel. Studenten können Sequenz Umweltproben und nach Abschluss der Sequenz zur Verfügung Bioinformatik-Werkzeuge verwenden, um zu identifizieren und zu charakterisieren, Mikroben und Metagenomik-Sequenzen in Proben. Mit der NS-Technologie, haben Studenten echte praktische Erfahrung, die bis jetzt von wegen der fortgeschrittenen technischen Know-how und hohe Reagenz, Ausrüstung und Wartung Kosten in anderen Sequenzierung Plattformen für den Einsatz in Laborübungen erreichen hat. Einer unserer Schüler (J. Harrison, persönliche Mitteilung) berichtete kürzlich, den Einsatz dieser Technologie in ein Umweltprojekt Überwachung der landwirtschaftlichen Böden. Wir rechnen damit, dass viele weitere Anwendungen für diese Technologie im Bereich Bildung.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt war teilweise Unterstützung von Johns Hopkins Universität, Büro des Propstes durch die Gateway Science Initiative.
Materials
| Thermal Cycler | LifeECO | BTC42096 | |
| Covaris g-TUBE | Covaris | 520079 | |
| NEBNext End Repair Module | New England BioLab | E7546 | |
| Eppendorf LoBind Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | |
| NEB Blunt/TA Ligase Master Mix | New England BioLab | MO367 | |
| MyOne C1 Strepavidin Beads | Thermo Fisher | 65001 | |
| Eppendorf microcentrifuge | Eppendorf | Model 5420 | |
| Nanodrop UV spectrophotometer | Thermo Fisher | ND-2000 | Model 2000 |
| Belly Dancer Orbital Shaker | Sigma-Aldrich | Z768499 | |
| Power Soil DNA Isolation Kit | MO BIO | 12888-50 | |
| Ligation Sequencing Kit 2D | Oxford Nanopore | SQK-LSK208 | |
| Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | |
| End-Prep Reaction Buffer and enzyme mix (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix) | New England BioLab | MO367 | |
| AmPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Basic Starter Pack | Oxford Nanopore | Includes MinION Sequencing Device and Flow Cell | |
| MinKNOW software | Oxford Nanopore | ||
| Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | Includes Running Buffer with Fuel (RBF), Fragmentation Mix (FRM) Rapid Adapter (RAD) Library Lodaing Beads (LLB) |
References
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