Séquençage de l’ADN pour l’analyse métagénomique sol NANOPORE
Summary
Nanopore technologie des biomolécules de séquençage a de vastes applications dans les sciences de la vie, y compris l’identification de pathogènes, surveillance de la sécurité alimentaire, analyse génomique, la surveillance de l’environnement métagénomiques et caractérisation des bactéries résistance aux antibiotique. Dans cet article, la procédure de séquençage de l’ADN du sol métagénomique pour identifier les espèces utilisant la technologie de séquençage nanopore est illustrée.
Abstract
Cet article décrit les étapes de construction d’une bibliothèque d’ADN du sol, préparation et utilisation de la cellule de flux nanopore et l’analyse des séquences ADN identifié à l’aide de logiciels. Séquençage de l’ADN nanopore est une technique souple qui permet pour le séquençage de génomes microbiens rapide identifier les espèces bactériennes et virales, de caractériser les souches bactériennes et pour détecter les mutations génétiques qui confèrent une résistance aux antibiotiques. Les avantages de nanopore séquençage (NS) pour les sciences de la vie sont sa faible complexité, coût réduit et rapide en temps réel séquençage de l’ADN génomique purifié, PCR amplicons, échantillons de cDNA ou l’ARN. NS est un exemple de « séquençage de brin » qui implique le séquençage de l’ADN en guidant une seule molécule d’ADN échouée à travers un nanopore qui s’insère dans une membrane de polymère synthétique. La membrane dispose d’un courant électrique appliqué dessus, alors que les bases individuelles passent par le nanopore le courant électrique est perturbé à des degrés divers par les quatre bases nucléotidiques. L’identification de chaque nucléotide se produit en détectant la modulation caractéristique du courant électrique par les différentes bases pendant qu’ils traversent la nanopore. Le système de NS se compose d’un ordinateur de poche, alimenté par USB, appareil portatif et une cellule d’écoulement jetables qui contient un tableau nanopore. Le dispositif portatif se branche sur un ordinateur portable standard qui lit et enregistre la séquence d’ADN à l’aide de logiciels.
Introduction
Cette procédure vise à montrer les étapes nécessaires à la préparation d’une bibliothèque d’ADN environnementale de séquençage, utilisation d’un appareil de séquençage nanopore flux cellulaire et d’effectuer une analyse des séquences ADN générés à l’aide du logiciel système et le National Center for outils bioinformatiques Biotechnology Information (NCBI) pour identifier une espèce microbienne dans le sol. Actuellement, la plupart des plateformes de séquençage de l’ADN prévoient un investissement majeur dans la formation technique et des instruments complexes, qui ne sont pas faisable dans les environnements de pauvres ressources ou en applications sur le terrain. La plate-forme de séquençage (NS) nanopore élimine ces problèmes avec un coût-efficacité, simple à utiliser le protocole de préparation de bibliothèque et un dispositif portable de séquencer et d’analyser une variété de différents types d’acides nucléiques1,3. Nous avons incorporé la plate-forme NS dans plusieurs classes de laboratoire pour les étudiants de maîtrise.
Nanopore technologie des biomolécules de séquençage a démontré des applications larges dans les sciences de la vie, y compris l’identification des agents pathogènes bactériens et viraux1,2,6, la biodiversité environnementale études, surveillance de la sécurité alimentaire, l’analyse génomique3,5et caractérisation de la résistance bactérienne aux antibiotiques4. NS est une méthode rapide et précise de la séquence d’acides nucléiques qui se fonde sur le principe de « chapelet de séquençage » en détectant les perturbations électriques en bases nucléotidiques individuels lorsque seul ADN bicaténaire passe à travers un nanopore insérée dans un électrifiée membrane de polymère synthétique. Les étapes à suivre pour préparer l’ADN pour NS comprennent la fragmentation du génome, réparation fin et 3′ dA-tailing des fragments génomiques, adaptateur et d’attache recuit à l’ADN, ADN bibliothèque purification et chargement de la bibliothèque dans le dispositif de cellule de flux nanopore. Fragmentation du génome en kb ~ 8 tailles s’effectue par 1 à 2 µg d’ADN génomique à travers un tube de fragmentation g-tube de centrifugation. Les extrémités de génomiques fragmentées sont ensuite réparées et queue avec dA poly à l’aide d’un kit disponible dans le commerce. Séquences d’adaptateur brin unique, qui sont compatibles avec la protéine motrice nanopore, sont ajoutés aux extrémités de l’ADN qui servent à guider la séquence d’ADN par l’intermédiaire de la nanopore (Figure 1). Les séquences d’attache sont requis pour la purification de l’ADN et pour localiser les molécules d’ADN à la membrane de porosité. L’épingle est générée en ligaturant un adaptateur en épingle à cheveux à une extrémité de la bibliothèque à queue dA. Les structures en épingle à cheveux à l’extrémité de l’ADN permet la lecture des brins sens et antisens car l’ADN traverse le nanopore (Figure 2). La banque génomique préparée est ensuite purifiée à partir la réaction à l’aide de streptavidine perles en utilisant un champ magnétique, puis en chargeant l’échantillon dans la cellule d’écoulement nanopore pour analyse.
L’ADN séquencée est évaluée pour la qualité et des lectures de séquençage qui sont acceptables pour l’analyse sont ensuite soumises à plusieurs outils de bio-informatique pour identifier les microbes. Les séquences sont « traduites » en un FASTQ d’un format FAST5. Dans le format FASTQ, les séquences puis peuvent être utilisés que dans l’analyse de l’explosion.
Protocol
Representative Results
Discussion
De nombreuses méthodes de séquençage génération suivante ont été générés et chacun dépend de séquençage par synthèse, mais les plates-formes de détection pour identifier les nucléotides diffèrent. NS, la plus récente addition au marché, utilise une méthode différente tout à fait, qui ne nécessite pas une réaction de séquençage ou étiqueté nucléotides. Cette méthode tire parti des prime de frais de nucléotides déjà constituées pendant qu’ils traversent un pore électrifié. L’identification de chaque nucléotide se fait par modulation du courant électrique par les différentes bases pendant qu’ils traversent la nanopore. Ce système multiplexé permet à l’utilisateur de nombreux fragments de séquences à la fois. En séquençant les deux brins de l’ADN, l’exactitude de la séquence s’accroît et le logiciel de séquençage, ce qui peut être chargé sur un ordinateur portable, traite les signaux et fournit les informations de séquence qui peuvent être analysées.
Dans pyrosequencing, un séquençage par la méthode de synthèse (SBS), détection de la base spécifique incorporée dans le modèle dépend de l’analyse de luciferase et la génération de signaux par chimiluminescence8. Dans le séquençage d’ion de semi-conducteur, l’ion d’hydrogène libérée, ce qui diminue le pH est détectée par un capteur d’ion9. Séquençage en temps réel de l’unique molécule dépend le zéro mode wave guide (ZMW)10, qui s’allume pour la détection d’une molécule fluorescente taggée pour le nucléotide incorporé. SBS utilise une méthode unique pour amplifier l’ADN cible, telle que les grappes de séquences uniques sont générés13. Détection du nucléotide ajouté est obtenue quand la fluorescence des nucléotides marqués est enregistrée. NS a en revanche un avantage unique par rapport aux autres méthodes car il nécessite des moyens techniques limités, est portable, produit depuis longtemps des lectures de séquençage, n’exige aucun préalable amplification de l’ADN et peut être commandé à un coût réduit par rapport aux autres méthodes. Nos étudiants trouvent le protocole de préparation bibliothèque plus récente, rapide simple et se prêtent à une classe de laboratoire de trois heures. Certaines des questions que nous avons rencontrés étaient des bulles dans la cellule de flux qui ont été difficiles à enlever, il a fallu puissance informatique significative (un téraoctet de stockage), le courant de la sortie de données est dans un fichier FAST5 et la cellule d’écoulement de séquençage a une durée de vie limitée avant elle se détériore. En outre, les autres inconvénients du protocole NS ligature séquençage (protocole long) est qu’il nécessite plusieurs étapes de préparation de bibliothèque, nécessite une expertise dans les techniques de biologie moléculaire et génère la fidélité de séquençage réduit par rapport à certains méthodes de séquençage3. Toutefois, les progrès récents avec le nouveau kit de préparation rapide bibliothèque nécessite seulement 10 min pour la préparation de la bibliothèque et a démontré un taux d’erreur de séquençage réduit. La nouvelle méthode de préparation de bibliothèque était très favorable pour une utilisation dans une classe de laboratoire.
Il y a plusieurs étapes cruciales dans le protocole, en particulier dans le CQ de la cellule de flux. Cela inclut effectuant un QC initial dans les cinq jours suivant la réception de la cellule de flux et de leur utilisation dans les 8 semaines. Bien que nous avons utilisé des cellules d’écoulement qui étaient au delà de 8 semaines, le nombre de pores ouverts et actifs est grandement réduit. Il est important que les expériences sont prévues pour s’adapter à un scénario où une utilisation maximale des cellules flux est atteint. Nous avons utilisé le protocole de nettoyage et réutilisé les cellules d’écoulement avec succès.
Enquête sur la métagénomique de représentent un réservoir génétique inexploité de la diversité microbienne de la sol. Par exemple, un gramme de sol estime contiennent entre 107 – 109 cellules procaryotes14. En outre, les organismes du sol sont une source principale de nouveaux produits naturels, enzymes et d’antibiotiques. Ainsi, l’analyse des séquences ADN sols métagénomique représente un outil pédagogique précieux pour les étudiants à tous les niveaux de l’éducation. La technologie NS facilité d’utilisation et de faible coût faire ce système un outil pédagogique très efficace. Les élèves peuvent séquencer les échantillons environnementaux et à la fin de la séquence, utilisez outils bioinformatiques disponible pour identifier et caractériser les séquences de microbes et métagénomique dans des échantillons de test. Utilisant la technologie de NS, étudiants ont une expérience pratique véritable, qui a jusqu’à maintenant été de rejoindre destiné aux cours de laboratoire en raison de l’expertise technique de pointe et des coûts élevés de réactif, équipement et entretien dans les autres plateformes de séquençage. Récemment, un de nos étudiants (J. Harrison, communication personnelle) a signalé l’utilisation de cette technologie dans un projet de surveillance environnementale des sols agricoles. Nous attendons qu’il y aura beaucoup plus d’applications de cette technologie dans l’espace de l’éducation.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet a été prise en charge en partie par l’Université Johns Hopkins, Bureau du prévôt à travers la passerelle Science Initiative.
Materials
| Thermal Cycler | LifeECO | BTC42096 | |
| Covaris g-TUBE | Covaris | 520079 | |
| NEBNext End Repair Module | New England BioLab | E7546 | |
| Eppendorf LoBind Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | |
| NEB Blunt/TA Ligase Master Mix | New England BioLab | MO367 | |
| MyOne C1 Strepavidin Beads | Thermo Fisher | 65001 | |
| Eppendorf microcentrifuge | Eppendorf | Model 5420 | |
| Nanodrop UV spectrophotometer | Thermo Fisher | ND-2000 | Model 2000 |
| Belly Dancer Orbital Shaker | Sigma-Aldrich | Z768499 | |
| Power Soil DNA Isolation Kit | MO BIO | 12888-50 | |
| Ligation Sequencing Kit 2D | Oxford Nanopore | SQK-LSK208 | |
| Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | |
| End-Prep Reaction Buffer and enzyme mix (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix) | New England BioLab | MO367 | |
| AmPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Basic Starter Pack | Oxford Nanopore | Includes MinION Sequencing Device and Flow Cell | |
| MinKNOW software | Oxford Nanopore | ||
| Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | Includes Running Buffer with Fuel (RBF), Fragmentation Mix (FRM) Rapid Adapter (RAD) Library Lodaing Beads (LLB) |
References
- Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).
- Greninger, A. L., et al. Rapid metagenomics identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis. Genome Med. 7, 99 (2015).
- Quick, J., et al. Rapid draft sequencing and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella. Genome Biology. 16, 114 (2015).
- Ashton, P. M., et al. MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of a bacterial antibiotic resistance island. Nat Biotechnol. 33, 296-300 (2015).
- Loman, N. J., Quick, J., Simpson, J. T. A complete bacterial genome assembled de novo. using only nanopore sequencing data. Nat Method. 12, 733-735 (2015).
- Hoenen, T., et al. Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Outbreak Tool. Emerg Infect Dis. 22 (2), 331-334 (2016).
- Petrosino, J. F., Highlander, S., Luna, R. A., Gibbs, R. A., Versalovic, J. Metagenomic pyrosequencing and microbial identification. Clin Chem. 55 (5), 856-866 (2009).
- Cummings, P. J., Ahmed, R., Durocher, J. A., Jessen, A., Vardi, T., Obom, K. M. Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization. J. Vis. Exp. (78), e50405 (2013).
- Rothberg, J. W., et al. An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing. Nature. 475, 348-352 (2011).
- Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations. Science. 299, 682-686 (2003).
- Eid, J., et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323, 133-138 (2009).
- Stoddart, D., Heron, A. J., Mikhailova, E., Maglia, G., Bayley, H. Single-nucleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with a biological nanopore. PNAS. 106, 7702-7707 (2009).
- Shendure, J., Hanlee, J. Next generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
- Daniel, R. The Metagenomics of Soil. Nat Rev Microbiol. 3, 470-478 (2005).
