Nanopore DNA rangschikkend voor Metagenomic bodemanalyse
Summary
Nanopore technologie voor sequencing biomoleculen heeft brede toepassingen in de biowetenschappen, met inbegrip van de identificatie van ziekteverwekkers, voedsel veiligheid controle genomic analyse, metagenomic milieumonitoring en karakterisering van bacteriële resistentie tegen antibiotica. In dit artikel wordt de procedure voor het rangschikken van het DNA van de bodem van het metagenomic voor soorten identificatie met behulp van de technologie van het rangschikken nanopore aangetoond.
Abstract
Dit artikel beschrijft de stappen voor de bouw van een DNA-bibliotheek van de bodem, voorbereiding en het gebruik van de cel van de stroom nanopore, en analyse van de DNA-sequenties geïdentificeerd met behulp van computersoftware. Nanopore DNA sequencing is een flexibele techniek die voor snelle microbiële genoom sequencing te identificeren van bacteriële en virale soorten, zorgt te karakteriseren bacteriestammen, en om op te sporen van genetische mutaties die verlenen van resistentie tegen antibiotica. De voordelen van de nanopore rangschikking (NS) voor life sciences zijn haar lage complexiteit, lagere kosten en snelle real-time sequentiebepaling van gezuiverde genomic DNA, PCR waarbij, cDNA monsters of RNA. NS is een voorbeeld van “strand sequencing” waarbij DNA sequencing door het begeleiden van een enkele gestrande DNA-molecule door middel van een nanopore dat is ingevoegd in een synthetisch polymeer-membraan. Het membraan is een elektrische stroom overheen, dus als de individuele honken passeren van de nanopore de elektrostroom zijhetelkinverschillende mate wordt verstoord door de vier basen nucleotide toegepast. De identificatie van elk nucleotide treedt op door het detecteren van de karakteristieke modulatie van de elektrische stroom door de verschillende basen als ze de nanopore passeren. Het NS-systeem bestaat uit een handheld, USB aangedreven draagbaar apparaat en een wegwerp stroom cel een matrix van nanopore bevat. Het draagbare apparaat aangesloten op een standaard laptopcomputer die leest en registreert de opeenvolging van DNA met behulp van computersoftware.
Introduction
Het doel van deze procedure is om aan te tonen de stappen die nodig zijn voor de voorbereiding van een milieu bibliotheek van DNA sequencing, gebruik van een nanopore stroom cel sequencing apparaat, en voor het uitvoeren van de analyse van de gegenereerde DNA-sequenties met behulp van system-software en het National Center for biotechnologie informatie (NCBI) bioinformatica tools te identificeren van microbiële soorten in de bodem. Momenteel vereisen de meeste DNA sequencing platformen een grote investering in technische opleiding en complexe instrumentatie, die niet haalbaar in resource slechte omgevingen of in veld toepassingen is. De nanopore sequencing (NS) platform elimineert deze problemen met een kosten-effectieve, eenvoudig te gebruiken protocol van de voorbereiding van de bibliotheek en een draagbaar apparaat om de volgorde en analyseren van een verscheidenheid van verschillende types van nucleïnezuren1,3. We hebben de NS platform verwerkt in verschillende klassen van de lab voor studenten van de master’s degree.
Nanopore technologie voor sequencing biomoleculen gebleken breed toepassingen in de biowetenschappen, met inbegrip van de identificatie van bacteriële en virale ziekteverwekkers1,2,6, milieu biodiversiteit studies, voedsel veiligheid controle, genomic analyse3,5, en karakterisering van bacteriële resistentie tegen antibiotica4. NS is een snelle en nauwkeurige methode om reeks nucleic zuren die is gebaseerd op het beginsel van “sequencing strand” door het detecteren van elektrische verstoring door individuele nucleotide basen wanneer één gestrande DNA een nanopore ingevoegd in een geëlektrificeerde passeert synthetische polymeren membraan. De stappen die betrokken zijn bij de voorbereiding van DNA voor NS omvatten genoom fragmentatie, einde reparatie en 3′ dA-tailing van genomic fragmenten, adapter en ketting gloeien tot het DNA, DNA bibliotheek zuivering en het laden van de bibliotheek in het nanopore apparaat voor de cel van de stroom. Fragmentatie van het genoom in ~ 8 kb grootte wordt bereikt door centrifugeren van 1-2 µg genomic DNA door middel van een g-buis fragmentatie buis. De gefragmenteerde genomic uiteinden zijn vervolgens gerepareerd en tailed met poly dA met behulp van een commercieel beschikbare kit. Één gestrande adapter sequenties, die verenigbaar met de nanopore motor proteïne zijn, worden toegevoegd aan DNA-uiteinden die worden gebruikt voor het begeleiden van de opeenvolging van DNA door de nanopore (Figuur 1). De tether-sequenties zijn vereist voor de zuivering van het DNA en voor het lokaliseren van de DNA moleculen naar de porie-membraan. De haarspeld wordt gegenereerd door een haarspeld-adapter op één uiteinde van de staart bibliotheek van dA ligating. De haarspeld structuren aan de uiteinden van DNA kunnen lezen van de betekenis en antisense strengen als het DNA passeert de nanopore (Figuur 2). De bereid genomic bibliotheek wordt dan gezuiverd van de reactie met behulp van daar kralen met behulp van een magnetisch veld, gevolgd door het laden van het monster naar de nanopore stroom cel voor analyse.
De gesequenceerd DNA is beoordeeld op kwaliteit en sequencing leest die acceptabel voor analyse zijn zijn vervolgens onderworpen aan verschillende bioinformatica tools te identificeren van microben. De sequenties worden “vertaald” in een FASTQ van een FAST5 indeling. Het formaat van de FASTQ, kunnen de sequenties vervolgens worden gebruikt in BLAST analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vele volgende generatie sequencing methoden zijn gegenereerd en elk hangt af van het rangschikken door synthese, maar de detectie-platforms voor het identificeren van nucleotiden verschillen. NS, de meest recente toevoeging aan de markt, gebruikt een andere methode volledig, die hoeft niet de reactie van een sequentie of label nucleotiden. Deze methode maakt gebruik van de gratis differentieel van reeds opgenomen nucleotiden als ze een geëlektrificeerde porie passeren. De identificatie van elk nucleotide treedt op door de modulatie van de elektrische stroom door de verschillende basen als ze de nanopore passeren. Dit multiplexed systeem kan de gebruiker naar de volgnummer van vele fragmenten tegelijk. Door beide strengen van DNA sequencing, de nauwkeurigheid van de sequentie wordt aanzienlijk verhoogd en de sequencing software, die kan worden geladen op een laptopcomputer, verwerkt de signalen en biedt de sequentie-informatie die kan worden geanalyseerd.
In pyrosequencing, een rangschikken door synthese (SBS) methode en hangt opsporing van de specifieke base in de sjabloon opgenomen af van de luciferase assay en de generatie van chemiluminescentie signalen8. In ion halfgeleider sequencing, wordt het vrijgegeven waterstof ion, dat de pH vermindert gedetecteerd door een ion sensor9. Enkel molecuul real-time sequencing, hangt af van de nul modus Golf gids (ZMW)10, die verlicht voor de detectie van een TL molecuul aan de opgenomen nucleotide gelabeld. SBS een unieke methode gebruikt voor het versterken van doelDNA zodanig dat clusters van unieke reeksen gegenereerde13. Detectie van de toegevoegde nucleotide wordt bereikt wanneer de fluorescentie van de tagged nucleotide is opgenomen. NS heeft aan de andere kant uniek voordeel ten opzichte van andere methoden in dat het beperkte technische middelen vereist, draagbaar is, lang sequencing leest produceert, geen voorafgaande versterking van DNA vereist, en tegen een verminderde prijs, vergeleken met andere methoden kan worden bediend. Onze studenten de nieuwere, snelle bibliotheek prep protocol eenvoudig en vatbaar voor een drie uur durende lab klasse aangetroffen. Enkele van de kwesties die we tegenkwamen waren bubbels in de cel van de stroom die moeilijk waren te verwijderen, het vereist aanzienlijke computer macht (één terabyte aan opslagruimte), de huidige output van gegevens is in een FAST5-bestand en de sequencing stroom cel heeft een beperkte houdbaarheid voordat het verslechtert. Daarnaast andere nadelen van het NS afbinding sequencing protocol (lange) is dat het vereist verschillende bibliotheek voorbereiding stappen vereist expertise in moleculaire biologietechnieken en genereert verminderde sequencing trouw in vergelijking met sommige sequencing methodologieën3. Echter, recente vooruitgang met de nieuwe snelle library voorbereiding kit vereist slechts 10 min voor de voorbereiding van de bibliotheek en een verminderde sequencing foutenpercentage heeft aangetoond. De nieuwe bibliotheek-voorbereiding methode was zeer vatbaar voor gebruik in een lab-klasse.
Er zijn verschillende kritische stappen in het protocol, met name in de QC van de stroom-cel. Dit omvat het uitvoeren van een eerste QC binnen vijf dagen na de ontvangst van de cel van de stroom en met behulp van hen binnen acht weken. Hoewel we hebben stroom cellen die buiten 8 weken werden gebruikt, is het aantal open/actieve poriën sterk verminderd. Het is belangrijk dat experimenten zijn gepland om te passen een tijdlijn waar maximaal gebruik van de cellen van de stroom is bereikt. Wij hebben de schoonmaak protocol gebruikt en hergebruikt de cellen van de stroom met succes.
Onderzoekt de metagenomics bodem vertegenwoordigen een onaangesproken genetische reservoir van microbiële diversiteit. Bijvoorbeeld, een gram van de bodem wordt geschat op tussen de 10 bevatten7 – 109 prokaryotische cellen14. Bovendien zijn de organismen in de bodem een hoofdbron van roman natuurproducten, enzymen en antibiotica. Bodem metagenomics DNA sequentieanalyse vormt aldus, een waardevol educatief hulpmiddel voor studenten op alle niveaus van het onderwijs. Van de technologie van de NS gebruiksgemak en lage kosten maken dit systeem een zeer effectieve leermiddel. Studenten kunnen volgnummer milieu monsters, en na voltooiing van de reeks gebruiken beschikbaar bioinformatica tools te identificeren en te karakteriseren van microben en metagenomics sequenties van analysemonsters. Met de technologie van de NS hebben studenten echte hands-on ervaring, die heeft tot nu toe uit bereiken voor gebruik in laboratorium cursussen vanwege de geavanceerde technische deskundigheid en hoge reagens, apparatuur en het onderhoud kosten in andere sequencing-platforms. Een van onze studenten (J. Harrison, persoonlijke mededeling) rapporteerde onlangs, het gebruik van deze technologie in een controle milieuproject van boerderij bodems. Wij verwachten dat er veel meer toepassingen voor deze technologie in het onderwijs ruimte zullen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project was steun ten dele door de Johns Hopkins University, Office van de Provost via de Gateway wetenschap initiatief.
Materials
| Thermal Cycler | LifeECO | BTC42096 | |
| Covaris g-TUBE | Covaris | 520079 | |
| NEBNext End Repair Module | New England BioLab | E7546 | |
| Eppendorf LoBind Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | |
| NEB Blunt/TA Ligase Master Mix | New England BioLab | MO367 | |
| MyOne C1 Strepavidin Beads | Thermo Fisher | 65001 | |
| Eppendorf microcentrifuge | Eppendorf | Model 5420 | |
| Nanodrop UV spectrophotometer | Thermo Fisher | ND-2000 | Model 2000 |
| Belly Dancer Orbital Shaker | Sigma-Aldrich | Z768499 | |
| Power Soil DNA Isolation Kit | MO BIO | 12888-50 | |
| Ligation Sequencing Kit 2D | Oxford Nanopore | SQK-LSK208 | |
| Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | |
| End-Prep Reaction Buffer and enzyme mix (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix) | New England BioLab | MO367 | |
| AmPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Basic Starter Pack | Oxford Nanopore | Includes MinION Sequencing Device and Flow Cell | |
| MinKNOW software | Oxford Nanopore | ||
| Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | Includes Running Buffer with Fuel (RBF), Fragmentation Mix (FRM) Rapid Adapter (RAD) Library Lodaing Beads (LLB) |
References
- Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).
- Greninger, A. L., et al. Rapid metagenomics identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis. Genome Med. 7, 99 (2015).
- Quick, J., et al. Rapid draft sequencing and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella. Genome Biology. 16, 114 (2015).
- Ashton, P. M., et al. MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of a bacterial antibiotic resistance island. Nat Biotechnol. 33, 296-300 (2015).
- Loman, N. J., Quick, J., Simpson, J. T. A complete bacterial genome assembled de novo. using only nanopore sequencing data. Nat Method. 12, 733-735 (2015).
- Hoenen, T., et al. Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Outbreak Tool. Emerg Infect Dis. 22 (2), 331-334 (2016).
- Petrosino, J. F., Highlander, S., Luna, R. A., Gibbs, R. A., Versalovic, J. Metagenomic pyrosequencing and microbial identification. Clin Chem. 55 (5), 856-866 (2009).
- Cummings, P. J., Ahmed, R., Durocher, J. A., Jessen, A., Vardi, T., Obom, K. M. Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization. J. Vis. Exp. (78), e50405 (2013).
- Rothberg, J. W., et al. An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing. Nature. 475, 348-352 (2011).
- Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations. Science. 299, 682-686 (2003).
- Eid, J., et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323, 133-138 (2009).
- Stoddart, D., Heron, A. J., Mikhailova, E., Maglia, G., Bayley, H. Single-nucleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with a biological nanopore. PNAS. 106, 7702-7707 (2009).
- Shendure, J., Hanlee, J. Next generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
- Daniel, R. The Metagenomics of Soil. Nat Rev Microbiol. 3, 470-478 (2005).
