نانوبوري تسلسل الحمض النووي لتحليل التربة الجينومية
Summary
تكنولوجيا نانوبوري لتسلسل الجزيئات الحيوية لها تطبيقات واسعة في مجال علوم الحياة، بما في ذلك تحديد مسببات الأمراض ورصد سلامة الأغذية، وتحليل الجينوم، ميتاجينوميك الرصد البيئي، وتوصيف للبكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية. ويتجلى في هذه المقالة، إجراءات الجينومية التربة تسلسل الحمض النووي لتحديد الأنواع باستخدام تكنولوجيا التسلسل نانوبوري.
Abstract
توضح هذه المقالة الخطوات اللازمة لبناء مكتبة الحمض النووي من التربة وإعداد واستخدام الخلية تدفق نانوبوري، وتحليل تسلسل الحمض النووي التعرف باستخدام برامج الحاسوب. تسلسل “الحمض النووي نانوبوري” هو تقنية مرنة تسمح لتسلسل الجينوم الميكروبية السريع التعرف على الأنواع البكتيرية والفيروسية، لتوصيف السلالات البكتيرية، والكشف عن الطفرات الوراثية التي تمنح المقاومة للمضادات الحيوية. وتشمل مزايا نانوبوري التسلسل (NS) لعلوم الحياة تعقيد منخفض وخفض التكلفة والتسلسل السريع في الوقت الحقيقي لتنقية الحمض النووي، أمبليكونس بكر، كدنا عينات أو الحمض النووي الريبي. NS هو مثال على “تسلسل حبلا” الذي ينطوي على تسلسل الحمض النووي من خلال توجيه جزيء الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحدة من خلال نانوبوري التي يتم إدراجها في غشاء بوليمر اصطناعية. الغشاء بتيار كهربائي يطبق عبرها، حيث تعطل الأسس الفردية التي تمر عبر نانوبوري التيار الكهربائي بدرجات متفاوتة من أربع قواعد النوكليوتيدات. تحديد كل النوكليوتيدات يحدث عن طريق الكشف عن تحوير المميزة للتيار الكهربائي بأسس مختلفة كما أنها تمر عبر نانوبوري. يتكون نظام NS من يده، USB بدعم الأجهزة المحمولة وخلية تدفق المتاح الذي يحتوي على مجموعة نانوبوري. يتم توصيل الجهاز المحمول كمبيوتر محمول قياسي يقرأ ويسجل تسلسل الحمض النووي باستخدام برامج الحاسوب.
Introduction
والهدف من هذا الإجراء هو لإظهار الخطوات المطلوبة لإعداد مكتبة الحمض النووي البيئية لتسلسلها، الاستفادة جهاز التسلسل خلية تدفق نانوبوري، والقيام بتحليل تسلسل الحمض النووي الذي تم إنشاؤه باستخدام برنامج نظام و المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (نكبي) أدوات المعلوماتية الحيوية لتحديد الأنواع الميكروبية في التربة. حاليا، معظم منصات تسلسل الحمض النووي تتطلب استثماراً كبيرا في التدريب التقني والأجهزة المعقدة، التي لا يمكن عمليا في بيئات فقيرة الموارد، أو في مجال التطبيقات. منهاج التسلسل (NS) نانوبوري يحل هذه المسائل مع فعالية التكلفة، بسيطة لاستخدام بروتوكول إعداد مكتبة، وجهاز محمول لتسلسل وتحليل مجموعة متنوعة من أنواع مختلفة من الأحماض النووية1،3. ادخلنا منهاج NS في العديد من الفئات مختبر لطلاب درجة الماجستير.
تكنولوجيا نانوبوري لتسلسل الجزيئات الحيوية أثبتت تطبيقات واسعة في مجال علوم الحياة، بما في ذلك تحديد مسببات الأمراض البكتيرية والفيروسية1،،من26، التنوع البيئي الدراسات ومراقبة سلامة الأغذية وتحليل الجينوم3،5وتوصيف للبكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية4. NS هو طريقة سريعة ودقيقة لتسلسل الأحماض النووية استناداً إلى المبدأ “تسلسل حبلا” عن طريق الكشف عن انقطاع الكهرباء عن وجود قواعد النوكليوتيدات الفردية عند الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد يمر عبر نانوبوري إدراجها في مكهرب غشاء البوليمر الاصطناعية. الخطوات المتبعة في إعداد الحمض النووي لتشمل NS تجزئة الجينوم والإصلاح نهاية 3 ‘ دا-تراجع من أجزاء الجينوم ومحول والحبل الصلب للحمض النووي، تنقية مكتبة الحمض النووي، وتحميل المكتبة إلى الجهاز خلية تدفق نانوبوري. يتم إنجاز تجزئة الجينوم إلى أحجام ~ 8 كيلو بايت من سينتريفوجينج 1-2 ميكروغرام من الحمض النووي من خلال أنبوب تجزئة ز-أنبوب. ثم إصلاح نهايات الجينوم المجزأ والذيل مع دا بولي باستخدام مجموعة أدوات متوفرة تجارياً. تسلسل محول واحد الذين تقطعت بهم السبل، ومتوافقة مع البروتين نانوبوري موتور، تتم إضافتها إلى نهايات الحمض النووي التي يتم استخدامها لتوجيه تسلسل الحمض النووي عن طريق نانوبوري (الشكل 1). تسلسل الحبل المطلوبة لتنقية الحمض النووي وإضفاء الطابع المحلي على جزيئات الحمض النووي للغشاء المسامية. دبوس تم إنشاؤه بواسطة ligating محول دبوس لواحدة من نهاية المكتبة دا الذيل. هياكل دبوس في نهايات الحمض النووي يسمح قراءة خيوط الشعور و antisense كالحمض النووي يمر عبر نانوبوري (الشكل 2). ثم هو تنقية مكتبة الجينوم استعداد من رد الفعل باستخدام الخرز ستريبتافيدين باستخدام حقل مغناطيسي، متبوعاً بتحميل العينة في الخلية تدفق نانوبوري للتحليل.
تسلسل الحمض النووي هو تقييم لجودة ويقرأ التسلسل المقبولة للتحليل ثم تتعرض للعديد من الأدوات المعلوماتية الحيوية للتعرف على الميكروبات. تتابع “ترجمة” إلى فاستق من تنسيق FAST5. في شكل فاستق، يمكن استخدام التسلسل ثم في تحليل الانفجار.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم إنشاء العديد من أساليب تسلسل الجيل القادم وكل يعتمد على التسلسل بتوليف لكن تختلف مناهج الكشف عن تحديد النيوكليوتيدات. NS، أحدث إضافة إلى السوق، يستخدم أسلوباً مختلفاً تماما، التي لا تتطلب رد فعل تسلسل أو تسمى النيوكليوتيدات. هذا الأسلوب يستفيد من تهمة التفاضلية النيوكليوتيدات أدرجت فعلا أنها تمر من خلال مسام مكهرب. تحديد كل النوكليوتيدات يحدث بالتحوير للتيار الكهربائي بأسس مختلفة كما أنها تمر عبر نانوبوري. هذا نظام متعدد يسمح للمستخدم بتسلسل أجزاء كثيرة في وقت واحد. حسب تسلسلها كل خيوط من الحمض النووي، هو إلى حد كبير زيادة دقة التسلسل وبرامج التسلسل، الذي يمكن تحميله على جهاز كمبيوتر محمول، معالجة الإشارات، ويوفر المعلومات التسلسل التي يمكن تحليلها.
في بيروسيكوينسينج، تسلسل بأسلوب التوليفي (SBS)، الكشف عن قاعدة محددة إدراجها في القالب يعتمد على الفحص لوسيفراس وتوليد إشارات تشيميلومينيسسينت8. في تسلسل أشباه الموصلات أيون، الكشف عن أيون الهيدروجين المفرج عنهم، مما يقلل من درجة الحموضة بواسطة أجهزة استشعار أيون9. التسلسل في الوقت الحقيقي جزيء واحد يعتمد على صفر وضع الموجه الدليل (زمو)10، الذي ينير للكشف عن جزيء الفلورسنت معلم إلى النوكليوتيدات مدمجة. SBS يستخدم طريقة فريدة من نوعها لتضخيم الحمض النووي الهدف أن مجموعات من تسلسل فريدة من نوعها ولدت13. كشف النوكليوتيدات وأضاف يتحقق عندما يتم تسجيل الأسفار النوكليوتيدات المعلمة. من ناحية أخرى قد NS ميزة فريدة من نوعها عبر طرق أخرى حيث أنه يتطلب الموارد التقنية المحدودة، والمحمولة، وتنتج منذ فترة طويلة ما يلي تسلسل، يتطلب أي تضخيم الحمض النووي السابقة، ويمكن تشغيلها بتكلفة مخفضة مقارنة بالأساليب الأخرى. ووجد طلابنا البروتوكول الإعدادية المكتبة الجديدة والسريعة لتكون واضحة وقابلة لفئة معمل ثلاث ساعات. بعض القضايا التي واجهناها كانت فقاعات في تدفق الخلية التي كان من الصعب إزالتها وأنها تتطلب طاقة الكمبيوتر كبير (واحد تيرابايت لتخزين)، أن الإنتاج الحالي للبيانات في ملف FAST5 والخلية تدفق تسلسل له فترة صلاحية محدودة قبل ذلك تتدهور. وباﻹضافة إلى ذلك، عيوب أخرى ربط NS تسلسل بروتوكول (طويل) هو أنه يتطلب عدة خطوات إعداد مكتبة، وتتطلب خبرة في تقنيات البيولوجيا الجزيئية، ويولد تسلسل انخفاض الدقة عند مقارنة ببعض تسلسل منهجيات3. بيد أن التقدم الذي أحرز مؤخرا مع مجموعة إعداد مكتبة السريع الجديدة يتطلب فقط 10 دقيقة لإعداد مكتبة وأثبت تسلسل انخفاض معدل خطأ. وكانت طريقة إعداد مكتبة جديدة جداً قابلة للاستخدام في فئة معمل.
هناك العديد من الخطوات الهامة في البروتوكول، ولا سيما في مراقبة الجودة للخلية تدفق. وهذا يشمل القيام مراقبة الجودة أولية في غضون خمسة أيام من تاريخ استلام الخلية تدفق واستخدام لهم في غضون 8 أسابيع. على الرغم من أننا استخدمنا تدفق الخلايا التي تتجاوز 8 أسابيع، هو تقلص إلى حد كبير عدد المسام المفتوحة/نشطة. من المهم أن تجارب مصممة لتناسب وضع جدول زمني حيث يتم تحقيق الاستفادة القصوى من الخلايا تدفق. لدينا تستخدم البروتوكول التنظيف وإعادة استخدام الخلايا تدفق بنجاح.
التحقيق metagenomics من التربة تمثل خزان وراثية غير مستغلة للتنوع الميكروبي. ويقدر على سبيل المثال، غرام واحد من التربة تحتوي على ما بين 107 -109 خلايا بدائية14. وعلاوة على ذلك، كائنات التربة أحد مصادر رئيسية للمنتجات الطبيعية الجديدة والأنزيمات والمضادات الحيوية. وبالتالي، يمثل تحليل تسلسل الحمض النووي ميتاجينوميكس التربة أداة تعليمية قيمة للطلاب في كل مستوى من التعليم. التكنولوجيا NS لسهولة الاستخدام ومنخفضة التكلفة جعل هذا النظام أداة تعليمية فعالة جداً. الطلاب يمكن أن تسلسل عينات بيئية، وعند انتهاء التسلسل استخدام أدوات المعلوماتية الحيوية المتاحة لتحديد وتوصيف تسلسل الميكروبات وميتاجينوميكس في عينات الاختبار. باستخدام تكنولوجيا NS، تتاح للطلاب الخبرة العملية الحقيقية، التي لديها حتى الآن تم الخروج من التوصل إلى لاستخدامها في دورات المختبرات بسبب الخبرة الفنية المتقدمة وارتفاع تكاليف الكاشف والمعدات والصيانة في منصات أخرى يسلسل. في الآونة الأخيرة، أفاد أحد الطلاب (ج. هاريسون، اتصال شخصي) استخدام هذه التكنولوجيا في مشروع رصد البيئي للتربة الزراعية. ونتوقع أن يكون هناك العديد من تطبيقات أكثر لهذه التكنولوجيا في مجال التعليم.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كان هذا المشروع الدعم جزئيا بجامعة جونز هوبكنز، مكتب قائد الشرطة العسكرية من خلال “بوابة مبادرة العلم”.
Materials
| Thermal Cycler | LifeECO | BTC42096 | |
| Covaris g-TUBE | Covaris | 520079 | |
| NEBNext End Repair Module | New England BioLab | E7546 | |
| Eppendorf LoBind Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | |
| NEB Blunt/TA Ligase Master Mix | New England BioLab | MO367 | |
| MyOne C1 Strepavidin Beads | Thermo Fisher | 65001 | |
| Eppendorf microcentrifuge | Eppendorf | Model 5420 | |
| Nanodrop UV spectrophotometer | Thermo Fisher | ND-2000 | Model 2000 |
| Belly Dancer Orbital Shaker | Sigma-Aldrich | Z768499 | |
| Power Soil DNA Isolation Kit | MO BIO | 12888-50 | |
| Ligation Sequencing Kit 2D | Oxford Nanopore | SQK-LSK208 | |
| Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | |
| End-Prep Reaction Buffer and enzyme mix (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix) | New England BioLab | MO367 | |
| AmPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Basic Starter Pack | Oxford Nanopore | Includes MinION Sequencing Device and Flow Cell | |
| MinKNOW software | Oxford Nanopore | ||
| Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | Includes Running Buffer with Fuel (RBF), Fragmentation Mix (FRM) Rapid Adapter (RAD) Library Lodaing Beads (LLB) |
References
- Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).
- Greninger, A. L., et al. Rapid metagenomics identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis. Genome Med. 7, 99 (2015).
- Quick, J., et al. Rapid draft sequencing and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella. Genome Biology. 16, 114 (2015).
- Ashton, P. M., et al. MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of a bacterial antibiotic resistance island. Nat Biotechnol. 33, 296-300 (2015).
- Loman, N. J., Quick, J., Simpson, J. T. A complete bacterial genome assembled de novo. using only nanopore sequencing data. Nat Method. 12, 733-735 (2015).
- Hoenen, T., et al. Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Outbreak Tool. Emerg Infect Dis. 22 (2), 331-334 (2016).
- Petrosino, J. F., Highlander, S., Luna, R. A., Gibbs, R. A., Versalovic, J. Metagenomic pyrosequencing and microbial identification. Clin Chem. 55 (5), 856-866 (2009).
- Cummings, P. J., Ahmed, R., Durocher, J. A., Jessen, A., Vardi, T., Obom, K. M. Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization. J. Vis. Exp. (78), e50405 (2013).
- Rothberg, J. W., et al. An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing. Nature. 475, 348-352 (2011).
- Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations. Science. 299, 682-686 (2003).
- Eid, J., et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323, 133-138 (2009).
- Stoddart, D., Heron, A. J., Mikhailova, E., Maglia, G., Bayley, H. Single-nucleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with a biological nanopore. PNAS. 106, 7702-7707 (2009).
- Shendure, J., Hanlee, J. Next generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
- Daniel, R. The Metagenomics of Soil. Nat Rev Microbiol. 3, 470-478 (2005).
