Determinando a expressão da superfície celular e a taxa endocítica de proteínas em culturas primárias de astrocitos usando a biotinilação

As proteínas na superfície celular desempenham uma variedade de papéis centrais para manter a função celular. Em muitos casos, sua atividade é dependente ou modulada por processos endocíticos que os sequestram temporariamente em locais intracelulares, ou que os direcionam para caminhos degradativos ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} . Aqui, destacamos 2 abordagens baseadas em biotinilação projetadas para permitir ao usuário marcar e isolar especificamente as proteínas expressas na membrana plasmática e as que foram internalizadas novamente. Através destes métodos, a expressão da superfície celular e a taxa endocítica de qualquer proteína de interesse podem ser quantificadas, permitindo assim uma avaliação mais clara da sua regulação.

Determinando a expressão relativa da proteína da superfície celular por biotinilação

A biotina ou vitamina B7, anteriormente conhecida como vitamina H ⁶ , é uma pequena molécula solúvel em água que pode ser usada para modificar quimicamente grupos amino, sulfidrilo e carboxilo reativos de moléculas biológicas. A cultura atual de reagentes de biotinilação de superfície celular consiste principalmente de ésteres de N-hidroxissuccinimida (sulfo-NHS) sulfonados com membrana e nanotoxinas (sulfo-NHS), de biotina ou seus derivados, projetados para reagir com as aminas presentes nas cadeias laterais de resíduos de lisina de proteínas expressas em A superfície celular quando estes se tornam desprotonados em condições básicas, resultando em este último formando uma ligação amida com a unidade de biotina ⁷ . Assim, modificadas, as proteínas da superfície celular podem então ser isoladas através do uso de avidina, uma proteína tetramerica de 66 – 69 kDa que possui grande afinidade pela biotina, que se liga ao último com uma constante de dissociação de aproximadamente 10 a ¹⁵ , marcando-a como uma das Interações não covalentes mais fortes conhecidas ⁸ </suP> ^{, 9} .

Uma série de métodos alternativos de quantificação da expressão protéica na superfície celular foram utilizados em estudos prévios. A rotulagem de células não permeabilizadas usando anticorpos marcados de forma fluorescente especificamente para a proteína de interesse, seguida pela visualização por microscopia de fluorescência, por exemplo, é uma abordagem comumente empregada, mas depende fortemente da disponibilidade de anticorpos que podem se ligar a epítopos extracelulares. Mais recentemente, os métodos que envolvem a utilização de proteínas quiméricas com fluoróforos sensíveis ao pH que reagem a exposição a meios ácidos também foram empregados com sucesso ¹⁰ . No entanto, tais ensaios geralmente envolvem a expressão exógena dessas construções em linhas celulares em que a proteína de interesse não é encontrada nativamente. Essas abordagens são, no entanto, capazes de fornecer informações valiosas sobre a localização subcelular e o itinerário exocítico daProteína alvo e, portanto, deve ser usado em conjunto com as abordagens baseadas em biotinilação aqui descritas se as ferramentas estiverem disponíveis.

Num ensaio de biotinilação típico, as células são primeiro lavadas completamente em PBS a 4 ° C. Isso remove qualquer vestígio de proteínas séricas introduzidas pelo meio de cultura, garantindo assim que estas não consumam quantidades excessivas de biotina no próximo passo. Mais importante ainda, a redução da temperatura faz com que a endocitose desacelere significativamente. O reagente de biotinilação é então adicionado. Em seguida, as células são lavadas novamente e depois incubadas com um tampão de extinção contendo glicina ou NH4C1, cujo objectivo é inactivar todos os vestígios restantes da biotina não reagida. As células são então lisadas, após o que é adicionada streptavidina imobilizada em agarose para precipitar as proteínas biotiniladas. A análise é comumente realizada via western blot, permitindo a expressão relativa da superfície celular de vários prOteins a serem quantificados.

Devido à base deste ensaio, é adequado para uso apenas com proteínas que possuem porções expostas ao ambiente extracelular. As proteínas transmembranares multipass, que provavelmente possuem uma série de lisinas reativas dentro de suas regiões de loop, são as mais favoráveis ​​a esse método, enquanto as proteínas de passagem única tendem a ser menos suscetíveis a serem biotiniladas. Mesmo nesses casos, existe a possibilidade de que mudanças conformacionais ou interações intermoleculares ocultem certos locais reativos, resultando em um rendimento de biotinilação inferior ao esperado.

Determinando a taxa de internalização das proteínas de superfície celular por biotinilação

Os princípios deste ensaio são em grande parte semelhantes aos da biotinilação celular, com várias exceções, sendo o mais importante o uso de reagentes reversíveis de biotinilação. Os grupos de biotina (destes) possuem disuLigação de ligações, dentro das suas estruturas, que são suscetíveis a agentes redutores; Isto é explorado para assegurar que apenas as proteínas de superfície celular tomadas nos locais intracelulares durante o período de ensaio serão deixadas biotiniladas. Um ensaio geralmente ocorre da seguinte maneira. As células são primeiro lavadas e biotiniladas com reagentes frios, então o meio de cultura de células a 37 ° C é reintroduzido e as células são devolvidas à incubadora; Isso faz com que as proteínas de superfície celular marcadas sofram endocitose. O agente redutor de glutationa – que não pode penetrar na membrana – é então adicionado para quebrar as ligações dissulfureto das porções de biotina ligadas às proteínas que permanecem na superfície celular. Finalmente, as ligações de dissulfureto quebradas são feitas reagir com iodoacetamida, consumindo os grupos de tiolos lábeis e impedindo que as ligações se reformem. Como antes, as células são então lisadas, e as proteínas marcadas são precipitadas usando estreptavidina-agarose.

O disco de limitaçõesUssed na seção anterior também se aplicam aqui devido às semelhanças compartilhadas entre os métodos. Além disso, vale a pena ter em mente que as mudanças de temperatura envolvidas neste ensaio impedem a determinação exata de quanta proteína é endocitada para cada incremento de tempo, particularmente no caso de proteínas de reciclagem rapidamente ou internamente recicladas. O ensaio, portanto, apenas fornece uma estimativa semiquantitativa das taxas endocíticas. A microscopia de fluorescência de reflexão interna total pode ser utilizada para rastrear a absorção de cada vesícula carregada e fornecer uma medida mais precisa da cinética da endocitose. Por conseguinte, pode proporcionar um complemento muito útil a este ensaio, assumindo que existe uma construção quimérica marcada de forma fluorescente da proteína de interesse ¹¹ .