ビオチン化を用いた初代星状細胞培養におけるタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度の測定

細胞表面のタンパク質は、細胞機能を維持する中心的な役割を果たしています。多くの場合、それらの活性は、細胞内部位でそれらを一時的に隔離するか、またはそれらを分解経路1,2,3,4,5に向かわせるエンドサイトーシスプロセスに依存するか、または調節される。ここでは、2つのビオチン化に基づく手法を用いて、細胞膜で発現されたタンパク質と新たに内在化されたタンパク質を特異的にタグ付けして単離できるようにしました。これらの方法を介して、関心対象のタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度を定量化することができ、したがってその調節のより明確な評価を達成することができる。

ビオチン化による相対的細胞表面タンパク質発現の測定

以前はビタミンH ⁶として知られていたビオチンまたはビタミンB7は、生体分子の反応性アミン、スルフヒドリルおよびカルボキシル基を化学的に修飾するために使用できる小さな水溶性分子である。細胞表面ビオチン化試薬の現在の作物は、主として、ビオチンまたはその誘導体の膜不透過性スルホン化N-ヒドロキシスクシンイミド（スルホ-NHS）エステルからなり、ここで発現されるタンパク質のリジン残基の側鎖に存在するアミンと反応するように設計されているこれらが塩基性条件下で脱プロトン化され、ビオチン部分とアミド結合を形成することになる。このように改変された細胞表面タンパク質は、ビオチンに対して大きな親和性を有し、約10 ^-15の解離定数を有する後者に結合する66〜69kDaの四量体タンパク質であるアビジンの使用によって単離され得る。最も強い非共有結合相互作用⁸ </sup> ^{、 9} 。

以前の研究では、細胞表面でタンパク質発現を定量化する多くの代替方法が用いられてきた。関心対象のタンパク質に特異的な蛍光標識された抗体を用いた不透過化細胞の標識は、例えば蛍光顕微鏡による視覚化が一般的に採用されているアプローチであるが、細胞外エピトープに結合する抗体の利用可能性に大きく依存する。より最近では、酸性培地に曝露することに反応するpH感受性フルオロフォアを有するキメラタンパク質の使用を含む方法も首尾よく用いられている¹⁰ 。しかしながら、このようなアッセイは、通常、目的のタンパク質がネイティブに見出されない細胞株におけるこれらの構築物の外因性発現を含む。それにもかかわらず、これらのアプローチは、細胞の局在化および細胞外経路に関する貴重な情報を提供することができるしたがって、ツールが利用可能である場合には、ここに記載されているビオチン化に基づくアプローチと併せて使用すべきである。

典型的なビオチン化アッセイでは、細胞をまず4℃のPBS中で完全に洗浄する。これにより、培地によって導入された微量の血清タンパク質が除去され、次のステップで過剰量のビオチンを消費しないことが保証されます。さらに重要なことに、温度の低下はエンドサイトーシスを著しく減速させる。次いで、ビオチン化試薬を添加する。次に、細胞を再び洗浄し、グリシンまたはNH ₄ Clのいずれかを含有するクエンチング緩衝液とインキュベートする。その目的は、未反応のビオチンのすべての痕跡を不活性化することである。次いで、細胞を溶解し、続いてアガロース固定化ストレプトアビジンを添加してビオチン化タンパク質を沈殿させる。分析は、ウェスタンブロッティングを介して一般的に行われ、様々なpr定量すべきoteins。

このアッセイの基礎のために、それは、細胞外環境に曝露された部分を有するタンパク質のみに用いるのに適している。シングルパスタンパク質はビオチン化されにくい傾向があるが、ループ領域内に多数の反応性リジンを有する可能性のあるマルチパス膜貫通タンパク質がこの方法に最も適している。これらの場合でさえも、構造変化または分子間相互作用が特定の反応部位を閉塞し、予想よりも低いビオチン化収率をもたらす可能性が残っている。

ビオチン化による細胞表面タンパク質の内在化速度の決定

このアッセイの原理は、細胞表面ビオチン化の原理に大いに類似しており、その中で最も重要なものは可逆的ビオチン化試薬の使用である。ビオチン基（これらの）は、還元剤の影響を受けやすい構造内の結合結合;これは、アッセイ期間中に細胞内部位に取り込まれた細胞表面タンパク質のみがビオチン化されたままであることを保証するために利用される。アッセイは、一般的に以下の方法で行われる。最初に細胞を洗浄し、冷たい試薬でビオチン化し、次いで37℃の細胞培地を再導入し、細胞をインキュベーターに戻す。これにより、標識された細胞表面タンパク質がエンドサイトーシスを受けるようになる。次いで、膜に浸透することができない還元剤であるグルタチオンを添加して、細胞表面上に残っているタンパク質に結合したビオチン部分のジスルフィド結合を破壊する。最後に、壊れたジスルフィド結合をヨードアセトアミドと反応させ、不安定なチオール基を消費し、結合が改質されないようにする。前と同様に、細胞を溶解し、標識タンパク質をストレプトアビジン – アガロースを用いて沈殿させる。

限界ディスク前のセクションでは、これらのメソッド間で共有されている類似性のためにここでも適用されます。さらに、このアッセイに伴う温度変化は、特に急速に内部移行したタンパク質または急速にリサイクルするタンパク質の場合に、各時間の増加につきどの程度の量のタンパク質がエンドサイトーシスされるかを正確に決定することを妨げるものである。従って、このアッセイは、エンドサイトーシス速度の半定量的な推定しか提供しない。全反射蛍光顕微鏡法を用いて、負荷された各小胞の取り込みを追跡し、エンドサイトーシスの動態のより正確な測定値を提供することができる。したがって、関心のあるタンパク質の蛍光標識されたキメラ構築物が利用可能であると仮定して、このアッセイに非常に有用な補完物を提供することができる。