קביעת הביטוי משטח תאים ושיעור אנדוציטי של חלבונים בתרבויות אסטרוציטיות ראשוניות באמצעות Biotinylation

חלבונים על פני התא לשחק מגוון של תפקידים מרכזי לשמירה על תפקוד התא. במקרים רבים הפעילות שלהם תלויה, או מאופיינת על ידי תהליכים אנדוציטיים, כי גם לרשום אותם באופן זמני באתרים תאיים, או לכוון אותם כלפי מסלולים השפלה ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} . כאן, אנו מדגישים 2 biotinylation מבוסס גישות שנועדו לאפשר למשתמש לתייג באופן ספציפי לבודד חלבונים לידי ביטוי על קרום פלזמה, ואלו החדשה הופנמו. באמצעות שיטות אלה, את פני השטח של התא ואת שיעור endocytic של כל חלבון של עניין ניתן לכמת, ובכך מאפשר הערכה ברורה של הרגולציה שלה להיות מושגת.

קביעת יחסית תא פני השטח חלבון הביטוי על ידי biotinylation

ביוטין, או ויטמין B7, המכונה בעבר ויטמין H ⁶ , הוא מולקולה מסיס מים קטן שניתן להשתמש בהם כדי לשנות כימית אמינים, sulfhydryl, קבוצות carboxyl של מולקולות ביולוגיות. היבול הנוכחי של ריאגנטים biotinylation פני השטח של התא מורכב בעיקר של קרום nul hydroxysuccinimide (sulfo-NHS) אסטרונומים של ביוטין או נגזרות שלה, שנועד להגיב עם אמינים נוכח על שרשראות הצד של ליסין שאריות של חלבונים לידי ביטוי ב את משטח התא כאשר אלה הופכים deprotonated בתנאים בסיסיים, וכתוצאה מכך האחרון להרכיב קשר amide עם מחלת ביוטין ⁷ . כך, למשל, חלבונים של תאי-תאים עשויים להיות מבודדים באמצעות שימוש ב- avidin, חלבון tetrameric של 66 – 69 kDa בעל זיקה רבה לביוטין, המחייב את השני עם קבוע דיסוציאציה של כ ^-15-15 , מסמן אותו כאחד אינטראקציות noncovalent החזק ביותר הידוע ⁸ </suP> ^{, 9} .

מספר שיטות חלופיות לכימות ביטוי חלבון על פני התא שימשו מחקרים קודמים. תיוג של תאים unpermeabilized באמצעות נוגדנים מתויגים fluorescently ספציפי לחלבון של עניין, ואחריו ויזואליזציה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, למשל, היא גישה נפוץ, אבל הוא מסתמך במידה רבה על הזמינות של נוגדנים שיכולים להיקשר epitopes תאיים. לאחרונה, שיטות המעורבות בשימוש חלבונים chimeric הנושאת fluorophores רגישים ל- pH המגיבים לחשיפה לחומרי חומצה, הועסקו בהצלחה גם ¹⁰ . עם זאת, מבחני כזה בדרך כלל כרוך הביטוי אקסוגני של מבנים אלה בקווים התא שבו החלבון של עניין לא נמצא באופן מקורי. גישות אלה בכל זאת מסוגלים לספק מידע בעל ערך לגבי לוקליזציה תת-תאית ומסע exocytic שלחלבון היעד, ולכן יש להשתמש בשילוב עם גישות biotinylation מבוסס המתואר כאן אם הכלים זמינים.

ב assay biotinylation טיפוסי, התאים נשטפים תחילה ביסודיות 4 מעלות צלזיוס PBS. זה מסיר כל עקבות של חלבונים בסרום הציג על ידי המדיום התרבות, ובכך להבטיח כי אלה לא יצרוך כמויות עודפות של ביוטין בשלב הבא. חשוב יותר, הירידה בטמפרטורה גורמת לאנדוציטוזה להאט משמעותית. מגיב biotinylation לאחר מכן הוסיף. לאחר מכן, התאים נשטפים שוב, ולאחר מכן מודגרות עם חיץ מרווה המכיל גם גליצין או NH ₄ Cl, המטרה של אשר היא להשבית את כל עקבות הנותרים של ביוטין בלתי ממומש. התאים הם lysed אז, בעקבות אשר agarose- משותק streptavidin נוסף כדי להאיץ את החלבונים biotinylated. ניתוח מבוצע בדרך כלל באמצעות סופג המערבי, ומאפשר את פני השטח של תא יחסית של יחסי ציבור שוניםOutins להיות לכמת.

בשל הבסיס של assay זה, הוא מתאים לשימוש רק עם חלבונים בעלי חלקים חשופים הסביבה תאיים. מולטיפאס טרנסממברני חלבונים, אשר סביר להניח שיש מספר lysines תגובתי בתוך אזורי לולאה שלהם, הם המתאימים ביותר לשיטה זו, ואילו חלבונים לעבור יחיד נוטים להיות רגישים פחות להיות biotinylated. אפילו במקרים אלה, נותרה אפשרות ששינויים קונפורמטיביים או אינטראקציות בין-מולקולאריות עשויים לחסום אתרים תגובתיים מסוימים, וכתוצאה מכך תשואה ביוטילינאצית נמוכה מהצפוי.

קביעת שיעור ההפנמה של חלבונים משטח התא על ידי biotinylation

העקרונות של assay זה דומים במידה רבה לאלה של biotinylation בתא השטח, עם מספר חריגים, החשוב שבהם הוא השימוש reagents biotinylation הפיך. קבוצות ביוטין (של אלה) יש disuLfide, בתוך המבנים שלהם, כי הם רגישים לצמצום סוכנים; זה מנוצל על מנת להבטיח כי רק חלבונים משטח התא נלקח לאתרים תאיים במהלך תקופת assay יישאר biotinylated. Assay מתרחשת בדרך כלל באופן הבא. התאים נשטפים הראשון biotinylated עם ריאגנטים קר, ואז בינוני תרבות התא ב 37 ° C הוא מחדש הציג, ואת התאים מוחזרים החממה; זה גורם לתאים שכותרתו חלבונים פני כדי לעבור אנדוציטוזה. הפחתת הסוכר גלוטתיון – אשר לא יכול לחדור את הממברנה – לאחר מכן הוסיף לשבור את הקשרים דיסולפיד של moieties ביוטין המצורפת חלבונים שנותרו על פני התא. לבסוף, קשרים disulfide שבור מגיבים עם iodoacetamide, לצרוך את קבוצות thiol labile ומניעת הקשרים מ רפורמה. כמו קודם, התאים הם lysed אז, ואת החלבונים שכותרתו הם זירז באמצעות streptavidin-agarose.

דיסק המגבלותבסעיף הקודם חל גם כאן בשל הדמיון המשותף בין השיטות. בנוסף, כדאי לזכור כי משמרות הטמפרטורה המעורבים assay זה למנוע את הקביעה המדויקת של כמה חלבון הוא endocytosed עבור כל תוספת של זמן, במיוחד במקרה של במהירות מופנם או במהירות מיחזור חלבונים. Assay ולכן מספק רק הערכה semiquantitative של שיעורי endocytic. סך הכל מיקרוסקופ השתקפות הקרינה הפנימית ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר ספיגה של כל שלפוחית ​​טעון לספק מדידה מדויקת יותר של הקינטיקה של אנדוציטוזה. זה יכול ולכן לספק השלמה מאוד שימושי assay זה, בהנחה כי fluorescently מתויג chimeric לבנות של חלבון של עניין זמין ¹¹ .