Détermination de l'expression de la surface cellulaire et du taux endocytique des protéines dans les cultures d'astritcy primaires utilisant la biotinylation

Les protéines à la surface de la cellule jouent une variété de rôles essentiels au maintien de la fonction cellulaire. Dans de nombreux cas, leur activité dépend ou est modulée par des processus endocytaires qui les séquestrent temporairement dans des sites intracellulaires ou qui les dirigent vers des voies de dégradation ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} . Ici, nous mettons en évidence 2 approches basées sur la biotinylation conçues pour permettre à l'utilisateur d'étiqueter et d'isoler spécifiquement les protéines exprimées à la membrane plasmatique et celles nouvellement internalisées. Grâce à ces méthodes, l'expression de la surface cellulaire et le taux endocytique de toute protéine d'intérêt peuvent être quantifiés, ce qui permet d'obtenir une évaluation plus claire de sa réglementation.

Détermination de l'expression relative de la protéine de surface cellulaire par biotinylation

La biotine, ou la vitamine B7, anciennement connue sous le nom de vitamine H ⁶ , est une petite molécule hydrosoluble qui peut être utilisée pour modifier chimiquement les groupes réactifs d'amine, de sulfhydryle et de carboxyle de molécules biologiques. La récolte actuelle des réactifs de biotinylation de surface cellulaire consiste principalement en des esters de biotine ou de dérivés N-hydroxysuccinimides (sulfo-NHS) à base de membrane imperméables à la membrane, conçus pour réagir avec les amines présentes sur les chaînes latérales de résidus de lysine de protéines exprimées à La surface de la cellule lorsque ceux-ci deviennent déprotonés dans des conditions basiques, ce qui entraîne la formation d'une liaison amide avec la fraction de biotine ⁷ . Les protéines de surface cellulaire ainsi modifiées peuvent ensuite être isolées par l'utilisation d'avidine, une protéine tétramère de 66 à 69 kDa possédant une grande affinité pour la biotine, se liant à celle-ci avec une constante de dissociation d'environ 10 à ¹⁵ , la marquant comme l'une des Les interactions non covalentes les plus fortes connues ⁸ </suP> ^{, 9} .

Un certain nombre de méthodes alternatives de quantification de l'expression des protéines à la surface de la cellule ont été utilisées dans des études antérieures. L'étiquetage de cellules non perméabilisées utilisant des anticorps marqués par fluorescence spécifiques de la protéine d'intérêt, suivi par la visualisation par microscopie par fluorescence, par exemple, est une approche couramment utilisée, mais dépend fortement de la disponibilité d'anticorps qui peuvent se lier à des epitopes extracellulaires. Plus récemment, des procédés impliquant l'utilisation de protéines chimères contenant des fluorophores sensibles au pH qui réagissent pour être exposés à des milieux acides ont également été utilisés avec succès ¹⁰ . Cependant, de tels tests impliquent habituellement l'expression exogène de ces constructions dans des lignées cellulaires dans lesquelles la protéine d'intérêt n'est pas trouvée nativement. Ces approches sont néanmoins capables de fournir des informations précieuses concernant la localisation subcellulaire et l'itinéraire exoctique de laCible, et devrait donc être utilisé conjointement avec les approches basées sur la biotinylation décrites ici si les outils sont disponibles.

Dans un dosage de biotinylation typique, les cellules sont tout d'abord lavées à fond dans du PBS à 4 ° C. Cela élimine toute traces de protéines sériques introduites par le milieu de culture, ce qui garantit que celles-ci ne consommeront pas d'excès de quantité de biotine dans l'étape suivante. Plus important encore, la réduction de la température entraîne une décélération significative de l'endocytose. Le réactif de biotinylation est ensuite ajouté. Ensuite, les cellules sont à nouveau lavées, puis incubées avec un tampon de trempe contenant soit de la glycine soit du NH ₄ Cl, dont le but est d'inactiver toutes les traces restantes de la biotine n'ayant pas réagi. Les cellules sont ensuite lysées, après quoi une streptavidine immobilisée à l'agarose est ajoutée pour précipiter les protéines biotinylées. L'analyse est généralement effectuée via Western Blot, ce qui permet l'expression relative de la surface cellulaire de divers prOteins à quantifier.

En raison de cette analyse, il convient à une utilisation uniquement avec des protéines possédant des parties exposées à l'environnement extracellulaire. Les protéines transmembranaires multipass, qui possèdent probablement un certain nombre de lysines réactives dans leurs régions en boucle, sont les plus favorables à cette méthode, tandis que les protéines à passage unique ont tendance à être moins susceptibles d'être biotinylées. Même dans ces cas, il existe une possibilité que des changements conformationnels ou des interactions intermoleculaires puissent occluser certains sites réactifs, ce qui entraîne un rendement de biotinylation inférieur à prévu.

Détermination du taux d'internalisation des protéines de surface cellulaire par biotinylation

Les principes de ce dosage sont largement similaires à ceux de la biotinylation de la surface cellulaire, avec un certain nombre d'exceptions, dont le plus important est l'utilisation de réactifs de biotinylation réversibles. Les groupes de biotine (de ceux-ci) possèdent le disuLfide bonds, dans leurs structures, susceptibles d'être réducteurs; Ceci est exploité pour s'assurer que seules les protéines de surface cellulaire prises dans les sites intracellulaires pendant la période d'analyse seront laissées biotinylées. Un dosage a généralement lieu de la manière suivante. Les cellules sont d'abord lavées et biotinylées avec des réactifs froids, puis un milieu de culture cellulaire à 37 ° C est réintroduit et les cellules sont renvoyées dans l'incubateur; Cela provoque une endocytose des protéines de surface cellulaire marquées. L'agent réducteur du glutathion – qui ne peut pas pénétrer dans la membrane – est ensuite ajouté pour briser les liaisons disulfure des fragments de biotine attachés aux protéines restant sur la surface de la cellule. Enfin, les liaisons disulfure cassées sont mises à réagir avec de l'iodoacétamide, consommant les groupes thiol labiles et empêchant les liaisons de se réformer. Comme auparavant, les cellules sont ensuite lysées, et les protéines marquées sont précipitées en utilisant de la streptavidine-agarose.

Le disque de limitationsDans la section précédente s'appliquent également ici en raison des similitudes partagées entre les méthodes. En outre, il convient de garder à l'esprit que les changements de température impliqués dans ce dosage empêchent la détermination exacte de la quantité de protéines endocytées pour chaque incrément de temps, en particulier dans le cas de protéines de recyclage rapidement ou rapidement recyclées. Le dosage ne fournit donc qu'une estimation semi-quantitative des taux endocytaires. La microscopie de fluorescence à réflexion interne totale peut être utilisée pour suivre l'absorption de chaque vésicule chargée et fournir une mesure plus précise de la cinétique de l'endocytose. Il peut donc fournir un complément très utile à ce dosage, en supposant qu'une construction chimère marquée par fluorescence de la protéine d'intérêt soit disponible ¹¹ .