والرزن الفسفرة وملزمة Microtubule جنبا إلى جنب مع تعريب بروتين تاو في خلايا سرطان القولون والمستقيم
Summary
ويصف هذه المخطوطة بروتوكولات موحدة لقياس هايبرفوسفوريليشن تاو، قياس ملزمة تاو microtubules، وتوطين تاو داخل الخلايا بعد العلاج بالعقاقير. ويمكن استخدام هذه البروتوكولات متكررة لفحص المخدرات أو غيرها من المركبات التي تستهدف الربط تاو هايبرفوسفوريليشن أو ميكروتوبولي.
Abstract
تاو المرتبطة microtubule البروتين هو بروتين الخلايا العصبية التي يموضع معظمها في محاور عصبية. عموما تاو أمر ضروري لعمل الخلايا العصبية العادية نظراً لأنها تشارك في الجمعية ميكروتوبولي وتحقيق الاستقرار. وإلى جانب الخلايا العصبية، يتم التعبير عن تاو في الثدي والبروستاتا، المعدة، القولون والمستقيم، وسرطان البنكرياس حيث يظهر هيكل مماثل تقريبا وتمارس مهام مماثلة تاو الخلايا العصبية. مقدار تاو وعن الفسفرة يمكن تغيير وظيفتها كعامل استقرار ميكروتوبوليس، ويؤدي إلى تطوير خيوط حلزونية المزدوجة في اضطرابات الأعصاب المختلفة، مثل مرض الزهايمر. من المهم تحديد الدولة الفسفرة تاو وخصائصها microtubule ملزمة. وباﻹضافة إلى ذلك، دراسة التعريب داخل الخلايا من تاو مهم في أمراض مختلفة. هذه المخطوطة تفاصيل البروتوكولات القياسية لقياس الفسفرة تاو وملزم تاو إلى microtubules في خلايا سرطان القولون والمستقيم مع أو بدون الكركمين والعلاج ليكل. يمكن استخدام هذه العلاجات لوقف انتشار خلايا السرطان والتنمية. يتم فحص توطين تاو داخل الخلايا باستخدام إيمونوهيستوتشيميستري والفحص المجهري [كنفوكل] أثناء استخدام كميات قليلة من الأجسام المضادة. ويمكن استخدام هذه فحوصات متكررة لفحص المركبات التي تؤثر على هايبرفوسفوريليشن تاو أو ملزمة microtubule. رواية المداواة المستخدمة لمختلف تاوباثيس أو وكلاء السرطان ذات الصلة يمكن أن توصف احتمال استخدام هذه البروتوكولات.
Introduction
واعتبرت تاو أصلاً البروتينات المرتبطة microtubule الحرارة مستقرة كان المنقي يشترك مع توبولين1. وأعرب تاو هو حصرا في أعلى حقيقيات النوى2،،من34. وتتمثل المهمة الرئيسية تاو هو السيطرة microtubule الجمعية1،،من56. كما أنه يسهم البلمرة microtubules7، النقل محواري8، والتغييرات في القطر محواري9، تشكيل قطبية عصبي، ونيوروديجينيريشن10. تاو أيضا بمثابة سقالة بروتين للتحكم في بعض مسارات الإشارات. تشير دراسات الدماغ الفئران إلى أن تاو العصبية وأنه يموضع أساسا في محاور عصبية11. نظراً لأن تاو أساسي البلمرة microtubule وتنمية الخلايا العصبية، تاو كان الافتراض بأن تلعب دوراً رئيسيا في التنمية محواري في الجهاز العصبي المركزي؛ كانت هذه الفرضية في وقت لاحق يتم التحقق من تجارب في المختبر و في فيفو . بالإضافة إلى الخلايا العصبية، وهو أعرب عن تاو في الخلايا غير العصبية المختلفة، بما فيها الكبد والكلى والعضلات خلايا12،13. وأعرب تاو هو أيضا في الثدي والبروستات، القولون، والمعدة، وسرطان البنكرياس خلية خطوط وأنسجة14،15،16،،من1718، 19-تاو موجود أيضا في هيئة إدراج التهاب العضل توبولوفيلامينتس الملتوية في الهيئات إدراج20.
تاو قد تحمل عدة تعديلات بوستترانسلاشونال. جميع التعديلات بوستترانسلاشونال، الفسفرة هي الأكثر شيوعاً. الفسفرة تاو زيادة إنقاص النسب ل microtubules، أخيرا المزعزعة للاستقرار في سيتوسكيليتون. وقد وصف مواقع الفسفرة خمسة وثمانون في البروتين تاو المعزولة من أنسجة المخ البشري مرض الزهايمر. وتشكل 53% من هذه المواقع، سيرين، ثريونين 41% وفقط 6% تيروزين بقايا21،،من2223. ويؤثر الفسفرة تاو التعريب والدالة وملزم، القابلية للذوبان وقابليته لتعديلات أخرى بوستترانسلاشونال. كما تاو الفسفرة إلى أكثر من المدى الطبيعي (أو مشبعة تماما مع مجموعات الفوسفات) يعرف باسم هايبرفوسفوريليشن التي يتطابق الخصائص الهيكلية والوظيفية لمرض الزهايمر24. يحافظ على الأداء السليم ل microtubules محواري تاو ويضمن أداء الخلايا العصبية طبيعية في ظل الظروف الفسيولوجية. ومع ذلك، فشل تاو هايبرفوسفوريلاتيد للحفاظ على ربط microtubule منظمة تنظيماً جيدا، مما تسبب في فقدان الخلايا العصبية بسبب تفكك microtubule. المستويات العادية من الفسفرة تاو مطلوبة من أجل تاو سليمة الأداء، لكن تاو فشل لتعمل بشكل طبيعي إذا تم تعديل مستوى الفسفرة المميزة لها، وإذا لم هايبرفوسفوريلاتيد25. في مرض الزهايمر، وبعض اضطرابات الأعصاب المرتبطة بالسن الأخرى، يصبح هايبرفوسفوريلاتيد تاو وأشكال خيوط حلزونية المزدوجة والتشابك نيوروفيبريلاري26،27. وهكذا، أساليب لتحديد الفسفرة تاو وملزمة microtubule هامان.
سرطان القولون والمستقيم، سرطان المرتبطة بالشيخوخة، الثالث الأكثر شيوعاً تشخيص السرطان والسرطان المسببة للوفاة الثالثة بارزة ل كل من الرجال والنساء28. سرطان القولون والمستقيم واحد من أنواع السرطان الرئيسية المسببة للوفاة في العالم الغربي29. نظراً لأن سرطان القولون والمستقيم ومرض الزهايمر المرتبطة بالشيخوخة، وكلاهما يحدث أساسا في البلدان المتقدمة حيث يتمتع الناس بالعادات الغذائية مماثلة، قد على نحو ما الربط بين هذين المرضين. وبالإضافة إلى ذلك، الخلايا السرطانية تاو-الإيجابية والسلبية تاو تستجيب بشكل مختلف لوكلاء العلاج الكيميائي، مثلاً، باكليتاكسيل16.
الكركمين واحد من المشتقات الرئيسية من كركم لونغا، الكركم التوابل الهندية30. لعدة قرون، السكان في جنوب آسيا قد استهلكت الكركم في وجباتهم بشكل يومي. الكركمين ويستخدم لعلاج الأمراض المختلفة، بما في ذلك سرطان القولون والمستقيم ومرض الزهايمر والسكري، التليف الكيسي، مرض التهاب الأمعاء، والتهاب المفاصل، والدهون، وتصلب الشرايين ومرض القلب الاقفاري31، 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38-الليثيوم أيضا يمكن أن تقتل خلايا سرطان القولون والمستقيم أو منع الانتشار على39. يمكن أيضا استخدام الليثيوم لعلاج مرض الزهايمر40 كما أنه يقلل من تراكم تاو ويمنع هايبرفوسفوريليشن، وكما لاحظ ماوس المعدلة وراثيا نموذج41،42،43، 44.
وتهدف هذه المخطوطة إلى: 1) قياس مجموع تاو ومستويات التعبير والرمات-تاو في الخلايا المعالجة؛ 2) تصف مقايسة الفوسفاتيز قياس الشامل تاو الفسفرة؛ 3) دراسة ملزمة microtubule من تاو؛ و 4) ترجمة تاو بالفحص المجهري [كنفوكل] في خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم، تعامل مع الكركمين أو ليكل. وتكشف النتائج أن خلية العلاج مع الكركمين، وهو عامل جيد يفترض أن العلاج الكيميائي لسرطان القولون، ويمكن أن تقلل من التعبير عن كلا تاو مجموع المعاملة مع ليكل وفوسفوريلاتيد تاو في خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم. يمكن أن تسبب هذه العلاجات أيضا النووية إزفاء من تاو. ومع ذلك، بشكل غير متوقع، يفشل الكركمين تحسين ربط تاو إلى microtubules.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذه المخطوطة شروط إجرائية مختلفة للكشف عن مجموع تاو وفوسفوريلاتيد تاو في خلايا سرطان القولون والمستقيم تعامل مع الكركمين وليكل. لتقييم حالة الفسفرة عموما تاو في عينات البروتين، وصفت مقايسة الفوسفاتيز. يمكن استخدام هذا الفحص يحتمل أن تكون دراسة حالة الفسفرة أي البروتين.
هذ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم إجراء هذا البحث كجزء من المشروع تحت عنوان ‘التنمية والتصنيع للمواد الخام مستحضرات التجميل ذات القيمة العالية من الطحالب البحرية’، وتموله وزارة للمحيطات ومصائد الأسماك، وكوريا، وأيده على منحة داخلية (2Z04930) من KIST معهد دانوي للمنتجات الطبيعية.
Materials
| HCT 116 cell | ATCC | CCL-247 | |
| MEM (EBSS) | Hyclone | SH30024.01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher (Gibco) | 16000044 | Store at -20 °C |
| penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA solution | WelGene | LS 015-01 | |
| 100 mm dish | Corning | 430161 | |
| 6 well plate | Corning | Coster 3516 | |
| Anti-Tau 13 antibody | abcam | ab19030 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Roche | 10 708 984 001 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Microlitre Centrifuges | Hettich Zentrifugen | MIKRO 200 R | |
| Paclitaxel | Sigma-Aldrich | T1912 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Curcumin | Sigma-Aldrich (Fluka) | 78246 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Microtubules (MT) | Cytoskeleton | MT001 | Store at 4 °C (desiccated) |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Store at 4 °C in the dark |
| Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Store at -20 °C |
| DPBS | WelGene | LB 001-02 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | Model 500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP | |
| PIPES | Sigma | P1851 | |
| Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Molecular Imager | Bio-Rad | ChemiDoc XRS+ | Store at 4 °C |
| Protein assay dye reagent | Bio-Rad | 500-0006 | |
| α-tubulin (11H10) Rabbit mAb | Cell signalling | 2125 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signalling | 2118 | |
| Anti-Tau (phospho S396) antibody | abcam | ab109390 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | Store at room temperature |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Thermo Scientific | EF0651 | Store at -20 °C |
| PMSF | Sigma | P7626 | Store at room temperature |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | Cell Signalling | 5870 | Store at 4 °C |
| Protease Inhibitor Cocktail | Cell Signalling | 5871 | Store at 4 °C |
| RIPA Buffer | Sigma | R 0278 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Tau-352 human | Sigma | T 9950 | Store at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X – 100 | Store at around 25 °C |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | |
| Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11005 | Store at 4 °C in the dark |
| Confocal Microscopy | Leica Microsystem | Leica TCS SP5 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix | 75819 | |
| Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Store at 4 °C |
References
- Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1858-1862 (1975).
- Cambiazo, V., Gonzalez, M., Maccioni, R. B. DMAP-85: a tau-like protein from Drosophila melanogaster larvae. J Neurochem. 64, 1288-1297 (1995).
- Goedert, M., et al. PTL-1, a microtubule-associated protein with tau-like repeats from the nematode Caenorhabditis elegans. J Cell Sci. 109 (Pt 11), 2661-2672 (1996).
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Jakes, R., Rutherford, D., Crowther, R. A. Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer’s disease. Neuron. 3, 519-526 (1989).
- Cleveland, D. W., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. Purification of tau, a microtubule-associated protein that induces assembly of microtubules from purified tubulin. J Mol Biol. 116, 207-225 (1977).
- Fellous, A., Francon, J., Lennon, A. M., Nunez, J. Microtubule assembly in vitro. Purification of assembly-promoting factors. Eur J Biochem. 78, 167-174 (1977).
- Witman, G. B., Cleveland, D. W., Weingarten, M. D., Kirschner, M. W. Tubulin requires tau for growth onto microtubule initiating sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 73, 4070-4074 (1976).
- Dixit, R., Ross, J. L., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. Differential regulation of dynein and kinesin motor proteins by tau. Science. 319, 1086-1089 (2008).
- Harada, A., et al. Altered microtubule organization in small-calibre axons of mice lacking tau protein. Nature. 369, 488-491 (1994).
- Caceres, A., Kosik, K. S. Inhibition of neurite polarity by tau antisense oligonucleotides in primary cerebellar neurons. Nature. 343, 461-463 (1990).
- Binder, L. I., Frankfurter, A., Rebhun, L. I. The distribution of tau in the mammalian central nervous system. J Cell Biol. 101, 1371-1378 (1985).
- Gu, Y. J., Oyama, F., Ihara, Y. tau is widely expressed in rat tissues. J Neurochem. 67, 1235-1244 (1996).
- Kenner, L., et al. Expression of three- and four-repeat tau isoforms in mouse liver. Hepatology. 20, 1086-1089 (1994).
- Souter, S., Lee, G. Microtubule-associated protein tau in human prostate cancer cells: isoforms, phosphorylation, and interactions. J Cell Biochem. 108, 555-564 (2009).
- Sangrajrang, S., et al. Estramustine resistance correlates with tau over-expression in human prostatic carcinoma cells. Int J Cancer. 77, 626-631 (1998).
- Rouzier, R., et al. Microtubule-associated protein tau: a marker of paclitaxel sensitivity in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8315-8320 (2005).
- Mimori, K., et al. Reduced tau expression in gastric cancer can identify candidates for successful paclitaxel treatment. Brit J Cancer. 94, 1894-1897 (2006).
- Jimeno, A., et al. Development of two novel benzoylphenylurea sulfur analogues and evidence that the microtubule-associated protein tau is predictive of their activity in pancreatic cancer. Mol Cancer Ther. 6, 1509-1516 (2007).
- Huda, M. N., Kim, D. H., Erdene-Ochir, E., Kim, Y. S., Pan, C. H. Expression, phosphorylation, localization, and microtubule binding of tau in colorectal cell lines. Appl Biol Chem. 59, 807-812 (2016).
- Askanas, V., Engel, W. K., Bilak, M., Alvarez, R. B., Selkoe, D. J. Twisted tubulofilaments of inclusion body myositis muscle resemble paired helical filaments of Alzheimer brain and contain hyperphosphorylated tau. The American journal of pathology. 144, 177-187 (1994).
- Buee, L., Bussiere, T., Buee-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res Brain Res Rev. 33, 95-130 (2000).
- Hanger, D. P., Anderton, B. H., Noble, W. Tau phosphorylation: the therapeutic challenge for neurodegenerative disease. Trends Mol Med. 15, 112-119 (2009).
- Sergeant, N., et al. Biochemistry of Tau in Alzheimer’s disease and related neurological disorders. Expert Rev Proteomics. 5, 207-224 (2008).
- Fath, T., Eidenmuller, J., Brandt, R. Tau-mediated cytotoxicity in a pseudohyperphosphorylation model of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 22, 9733-9741 (2002).
- Kolarova, M., Garcia-Sierra, F., Bartos, A., Ricny, J., Ripova, D. Structure and pathology of tau protein in Alzheimer disease. Int J Alzheimers Dis. 2012, 731526 (2012).
- Kosik, K. S., Joachim, C. L., Selkoe, D. J. Microtubule-associated protein tau (tau) is a major antigenic component of paired helical filaments in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4044-4048 (1986).
- Wood, J. G., Mirra, S. S., Pollock, N. J., Binder, L. I. Neurofibrillary tangles of Alzheimer disease share antigenic determinants with the axonal microtubule-associated protein tau (tau). Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4040-4043 (1986).
- Jemal, A., et al. Cancer statistics, 2003. CA Cancer J Clin. 53, 5-26 (2003).
- Patel, V. B., Misra, S., Patel, B. B., Majumdar, A. P. Colorectal cancer: chemopreventive role of curcumin and resveratrol. Nutr Cancer. 62, 958-967 (2010).
- Lim, G. P., et al. The curry spice curcumin reduces oxidative damage and amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse. J Neurosci. 21, 8370-8377 (2001).
- Venkatesan, N. Curcumin attenuation of acute adriamycin myocardial toxicity in rats. Br J Pharmacol. 124, 425-427 (1998).
- Srinivasan, M. Effect of curcumin on blood sugar as seen in a diabetic subject. Indian J Med Sci. 26, 269-270 (1972).
- Deodhar, S. D., Sethi, R., Srimal, R. C. Preliminary study on antirheumatic activity of curcumin (diferuloyl methane). Indian J Med Res. 71, 632-634 (1980).
- Rao, C. V., Rivenson, A., Simi, B., Reddy, B. S. Chemoprevention of colon carcinogenesis by dietary curcumin, a naturally occurring plant phenolic compound. Cancer Res. 55, 259-266 (1995).
- Araujo, C. C., Leon, L. L. Biological activities of Curcuma longa L. Mem Inst Oswaldo Cruz. 96, 723-728 (2001).
- Lim, T. G., et al. Curcumin suppresses proliferation of colon cancer cells by targeting CDK2. Cancer Prev Res (Phila). 7, 466-474 (2014).
- Ringman, J. M., Frautschy, S. A., Cole, G. M., Masterman, D. L., Cummings, J. L. A potential role of the curry spice curcumin in Alzheimer’s disease. Curr Alzheimer Res. 2, 131-136 (2005).
- Li, H., et al. Lithium chloride suppresses colorectal cancer cell survival and proliferation through ROS/GSK-3beta/NF-kappaB signaling pathway. Oxid Med Cell Longev. , 241864 (2014).
- Forlenza, O. V., De-Paula, V. J., Diniz, B. S. Neuroprotective effects of lithium: implications for the treatment of Alzheimer’s disease and related neurodegenerative disorders. ACS Chem Neurosci. 5, 443-450 (2014).
- Noble, W., et al. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by lithium correlates with reduced tauopathy and degeneration in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6990-6995 (2005).
- Perez, M., Hernandez, F., Lim, F., Diaz-Nido, J., Avila, J. Chronic lithium treatment decreases mutant tau protein aggregation in a transgenic mouse model. J Alzheimers Dis. 5, 301-308 (2003).
- Engel, T., Goni-Oliver, P., Lucas, J. J., Avila, J., Hernandez, F. Chronic lithium administration to FTDP-17 tau and GSK-3beta overexpressing mice prevents tau hyperphosphorylation and neurofibrillary tangle formation, but pre-formed neurofibrillary tangles do not revert. J Neurochem. 99, 1445-1455 (2006).
- Caccamo, A., Oddo, S., Tran, L. X., LaFerla, F. M. Lithium reduces tau phosphorylation but not A beta or working memory deficits in a transgenic model with both plaques and tangles. Am J Pathol. 170, 1669-1675 (2007).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Gupta, K. K., Bharne, S. S., Rathinasamy, K., Naik, N. R., Panda, D. Dietary antioxidant curcumin inhibits microtubule assembly through tubulin binding. FEBS J. 273, 5320-5332 (2006).
- Lee, J. W., Park, S., Kim, S. Y., Um, S. H., Moon, E. Y. Curcumin hampers the antitumor effect of vinblastine via the inhibition of microtubule dynamics and mitochondrial membrane potential in HeLa cervical cancer cells. Phytomedicine. 23, 705-713 (2016).
- Liu, F., et al. Site-specific effects of tau phosphorylation on its microtubule assembly activity and self-aggregation. Eur J Neurosci. 26, 3429-3436 (2007).
- Sultan, A., et al. Nuclear tau, a key player in neuronal DNA protection. J Biol Chem. 286, 4566-4575 (2011).
- Bukar Maina, M., Al-Hilaly, Y. K., Serpell, L. C. Nuclear Tau and Its Potential Role in Alzheimer’s Disease. Biomolecules. 6, 9 (2016).
- Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9, 790-803 (2010).
