Basit, sağlam ve yüksek üretilen iş tek bir molekül akışı germe tahlil uygulama boyunca DNA moleküllerinin taşıma eğitimi için
Summary
Bu iletişim kuralı tek boyutlu (1 D) Difüzyon boyunca DNA moleküllerinin çalışmak için bir basit, sağlam ve yüksek üretilen iş tek molekül akışı uzanan tahlil göstermektedir.
Abstract
Biz 1 D Difüzyon boyunca DNA moleküllerinin çalışmak için bir basit, sağlam ve yüksek üretilen iş tek molekül akışı uzanan tahlil tanımlamak. Bu tahlil, cam coverslips bir tek adımlı tepki silane-PEG-biotin ile functionalized. Akış hücreleri bir yapışkan bant functionalized coverslip ve giriş ve çıkış delik içeren bir PDMS levha arasında önceden kesilmiş kanalları ile sandviç tarafından inşa edilir. Birden fazla kanalı bir akış hücre entegre edilmiştir ve reaktifler akışına her kanal tam olarak, hangi önemli ölçüde tahlil işlem hacmi artar ve tahlil başına uygulamalı süresini azaltır otomatikleştirilebilir. Her kanal içinde biotin-λ-DNA’lar yüzeyde immobilize ve laminar akış akış-DNA’lar germek için uygulanır. DNA molekülleri için uzatılır > onların kontur uzunluğu ve hizmet % 80’i kadar dağınık şekilde genişletilmiş fluorescently etiketli moleküllerin bağlama ve taşıma etkinlik eğitim için şablonlar. Tek moleküllerin yörüngeleri izlenir tarafından hızlandırılmış toplam iç yansıma floresan (TIRF) görüntüleme. Ham görüntüleri otomatik olarak tek moleküllerinin DNA Difüzyon yörüngeleri tanımlamak ve onların 1 D Difüzyon sabitler tahmin etmek için standartlaştırılmış özel tek parçacık takip yazılımı kullanarak analiz edilir.
Introduction
Belirli hareket nasıl endojen proteinler Biyoloji uzun zamandır devam eden bir sorun olduğunu sitelerde genomu DNA hedeflerine hayatta ve çevresi için etkili bir şekilde yanıt vermek yeterince hızlı organizma için bulabilir. Çalışmalar son kırk yıl içinde önerilen ve büyük ölçüde DNA Kinetik bir protein tarafından arama hedef hipotez tarafından hızlandırılmış destek kolaylaştırılmış Difüzyon protein toplu 3D Difüzyon ve 1 D Difüzyon (dahil arasında geçiş yapar sürgülü ve süreçleri atlamalı) boyunca DNA1. Çoğu protein gen düzenlemesi, nükleik asit metabolizması ve diğer işlemler dahil DNA2,3,4,5,6,7 kayar yeteneğine artık bilindiği ,8,9. Ayrıca, son yıllarda yapılan çalışmalarda bile küçük peptidler bağlanmak ve DNA’LARINDA bir kargo taşıma yeteneği ile slayt bildirdi; Örneğin, bir protein molekülü veya DNA10,11,12,13,14boyunca PCR astar.
Son 15 yıl içinde tek molekül akışı uzanan tahlil yaygın bağlama ve DNA2,15,16boyunca moleküllerin Difüzyon çalışmaya kullanılmıştır. Bu tür tahlil, biotinylated çift iplikçikli DNA molekülün yüzeye immobilize ve laminar akış uygulandığı akış streç DNA. > % 80 gergin DNA’lar hizmet bağlama ve taşıma etkinliği ile fluorophores etiketli moleküllerin çalışmak için dağınık şekilde genişletilmiş Şablonlar olarak nerede DNA boyunca tek moleküllerin yörüngeleri hızlandırılmış Floresans görüntüleme tarafından izlenir. Bizim uygulama tekrarlanabilirlik ve rahat bir kullanım için optimize edilmiş, bu tahlil beş önemli adımlardan oluşur: biotin-λ-DNA, coverslip functionalization, akış hücre inşaat, Floresans görüntüleme ve veri analizi hazırlanması. Önceki iletişim kuralları17‘ de ilk tepki (3-Aminopropyl) ile triethoxysilane (APTES) ve sonra da direnir bir PEG katman oluşturmak için Amin-reaktif polietilen glikol (PEG) reaktifler (örneğin, NHS-PEG-biotin) ile cam coverslips functionalized nonspesifik adsorpsiyon tahlil bileşenleri coverslip yüzeye. Functionalized coverslips kalitesini büyük ölçüde PEG reaktifler ve reaksiyon koşulları her aşamada kalite bağlıydı. Basitleştirilmiş functionalization Protokolü ve hiçbir sıvı yapıştırıcı veya saat gün akışı hücrelerdeyse kür monte gerektiren çok katmanlı akışı hücre İnşaat bizim protokolünü açıklar. Biz de yoğun hesaplama regresyon adımları centroid Yerelleştirme18 ve Kovaryans tabanlı Difüzyon için Radyal simetri yöntemi uygulayarak ortadan kaldırır bir aerodinamik ve sağlam veri çözümleme yordamı11 tarif sürekli Tahmincisi19.
Burada, biz basit, sağlam raporu ve yüksek işlem hacmi tek molekül ile önemli gelişmeler coverslip functionalization, akış hücre yapı ve veri analizi yapılan germe tahlil uygulama akışı. Özellikle, temiz kuru coverslips doğrudan silane-PEG-biotin ile tepki bir tek adımlı coverslip functionalization Protokolü geliştirdik. Bu iletişim kuralı coverslip hazırlık basitleştirir ve standart iki aşamalı reaksiyon protokole göre functionalized yüzey kalitesini güvenilirliğini artırır. Coverslips functionalized-bu yüzden tutkal yapılacak sağlam boru bağlantıları etkinleştirmek çok kanallı PDMS akışı hücreleri ile nasıl kullanılacağını açıklar. Bu akış hücreleri daha fazla kurulum ve artan tahlil üretilen iş sırasında uygulamalı süresini azaltmak otomatik reaktif akışı sağlayan birden çok bilgisayar kontrollü giriş her akış odası için ekleyin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geleneksel iki adım coverslip functionalization tepki protokolü bir tek adımlı tepki protokole geçiş yaparken coverslip functionalization güvenilirliğini önemli ölçüde gelişmiş olduğunu fark ettim. Coverslip hazırlık için toplam uygulamalı süre az 30 dk olduğu, her gün tek molekül görüntüleme taze coverslips hazırlanması planlanan öneririz. Silane-PEG-biotin bozulma en aza indirmek için reaktif bölünmemeli ve kuru N2 gaz aldıktan sonra-20 ° C’de altında saklı olması gerekir. Burada biz -COO– üretmek PEG molekülleri veya son20dakika içinde kullanılan -CH3 terminal gruplarını kullanmayın. COO –– grupları ve hidrofobik -CH3 gruplar negatif suçlarından DNA molekülleri ve belirli protein örnekleri nonspesifik adsorpsiyon yüzeye, sırasıyla önlemek için kullanılmıştır. Silane-PEG-COOH ve/veya silane-PEG-CH3 -bazı protein örnekleri deneyleri için yararlı ya da koşullar ne zaman tahlil biz çok düşük yüzey adsorpsiyon küçük peptid örnekleri tam olarak biotin sonlandırılmış PEG yüzeyi tarafından gözlemlemek (pH gibi < 7,5) DNA-yüzey etkileşimleri teşvik.
Cam slayt akışı hücrelerden shift PDMS akışı akışı hücre inşaat hızlandırır hücreleri ve birden fazla kanal kolay entegrasyon sağlar. Biz sık sık functionalized coverslip başına sekiz bağımsız deneyler etkinleştirmek için akış hücre başına sekiz kanal mühendislik. Daha fazla coverslip başına iş çıkarma yeteneğini artırmak için mikro fabrikasyon kanalları daha büyük sayıda kullanılabilir.
İlk doldurma sonra herhangi bir kanal içinde hava kabarcık oluşumunu önlemek için tavsiye edilir. (Bu mümkün olmasına rağmen) genellikle, hava kabarcıkları gergin DNA’lar kaybına neden olmaz, ama oldukça akışını kesintiye uğratmak ve coverslip için sopa DNA’lar neden olabilirsiniz. Arabellek gaz giderme ve küçük yüzey aktif miktarları eklenmesi genellikle boru ve akışı kanal içinde kabarcık oluşumu önlemede etkilidir. Hava kabarcıkları için tüp nerede tanıtıldı durumlarda, Yavaș Akıș altında baloncuklar temizlemek ve onlar nerede DNA’lar gergin bölgeden akışı değil emin olmak deneyin.
Akıcı ve etkili veri analiz yazılımı oluşturulan veri büyük miktarda nedeniyle önemlidir. Genellikle ölçümleri bizim özel tek parçacık bir gün içinde dört çekirdekli işlemci ve 32 Gb bellek ile bir masaüstü bilgisayarda izleme yazılımı kullanarak işlenebilir bir akış cep 700.000 yüksek çözünürlüklü görüntüler toplamak. 1 D Difüzyon yörüngeler (Adım 5.5) yazılımı tarafından tespit yanlış pozitif oranı örnek bağımlı ve göz önüne alındığında oldukça düşük olabilir: 1) böylece küçük belirsizlik parçacıklar bağlama çerçeveleri () arasında FOV tek parçacık yoğunluğu düşük yeterli protein örnekleri genel peptid örnekleri daha fazla eğilimli coverslip için nonspesifik adsorpsiyon, ve böylece, örnek arabellek ve güç yoğunluğu her protein için optimize edilmiş olması gerekiyor); 2) böylece yanlış-parçacıklar tanımlaması ve olasılığı düşük olduğunu sinyal gürültü oranı tek parçacıkların kadar yüksektir. Yine de, belgili tanımlık bilgisayar yazılımı da zaman zaman hata yapabilir ve yazılım performansını değerlendirmek için sağlanan GUI kullanarak verilerin el ile muayene öneririz. Uygulamanın yanlış yörünge algılama için özellikle hassas, eşik değerini, minFrames, minTriplets ve Chi2_stat dahil olmak üzere işlem parametreleri doğru bağlama için daha düşük duyarlılık pahasına daha sıkı ayarlanabilir olaylar ve potansiyel olarak daha fazla istatistik önyargı yörünge tanımlama. Biz burada paylaşmak ve izleme yazılımı veri analiz yöntemleri standartlaştırmak ve en iyi uygulamalar hakkında tartışma teşvik yardımcı umut bizim tek parçacık açıklayın.
Sürekli akış DNA şablon molekülleri gergin durumunu korumak için görüntüleme sırasında gerektirir, bizim protokolünde atlamalı bir mekanizma ile diffüz veya eğer bazı proteinler DNA şablonları boyunca taşıma sıvı akış önyargı hidrodinamik etiketli fluorophore yarıçapı büyük22,23‘ tür. Böyle önyargı ölçülen ve çoğu veri kümelerini düzeltilmiş, proteinlerin taşıma ile küçük bir fluorophore etiketli ve sürgülü mekanizma tarafından Difüzyon tipik olarak algılanabilir bir ölçüde akışı2,4tarafındanönyargılı değil, 24. Özellikle, akım hızı proteinler DNA boyunca taşıma etkisini bir protein DNA23Difüzyon mekanizmaları incelemek için kullanılmıştır. A yakından akışının yokluğunda ölçümleri sağlayan alternatif bir yaklaşım kullanır DNA şablonları biotin geçici akışında uzatılır hem termini adlı ile ilgili ve DNA molekülün içinde kalır böyle coverslip için her iki uçta tarafından gergin bir Akış25,26,27,28açıldığında genişletilmiş yapılandırma. Çift-urgan yaklaşım akışı ücretsiz taşıma deneyler izin avantajı vardır ancak her iki ucunda da DNA şablon molekülleri, hayvan zinciri ve iki hayvan zinciri siteleri arasındaki mesafeleri karakterize sırasında dikkatli akış denetimi değiştirme gerektirir. Buna ek olarak, türdeş olmayan gerginlikler ve DNA konformasyon dinamikleri arasında DNA molekülün tek molekül tahlil üzerinde etkisi değerlendirilmesi gerekir.
Özet olarak, ek olarak 1 D Difüzyon boyunca DNA moleküllerinin eğitim, tek molekül olarak rapor tahlil birçok vitro biyokimyasal yararlanabilir ve DNA içeren tek molekül düzeyinde biyofiziksel çalışmaları ara işlemler tarafından hedef proteinler, DNA enzimatik faaliyetleri ve daha fazlası.
Sorun giderme
Sorun 1: Akış kanalları sızıntısı.
Çözüm: Öncelikle, akış kanalları tasarımı için sızdırmazlık çevresinde ve kanallar arasında en az 1,5 mm kenar boşluğu sağlar emin olun; ve, akış hücre montaj sırasında coverslip, çift-yapışkan bant ve PDMS levha arasında iletişim yüzeyler kuru, düz ve enkaz, mühür oluşturmak için uygulanan basınç üniforma, ücretsiz ve mühürleme işlemi olduğundan emin olun oda sıcaklığında gerçekleştirilen.
Sorun 2: Hayvan zinciri DNA’lar yoğunluğu çok düşüktür.
Çözüm: PEG functionalization verimliliği düşüktür veya DNA molekülleri ile biotin functionalized değil bu sorun ortaya çıkar. Bizim deneyim, hayvan zinciri DNA yoğunluğu için yüksek olmalıdır > coverslips % 90 ‘ taze hazırlanmış veya düzgün silane-PEG-biotin reaktif saklı. Hayvan zinciri DNA yoğunluğu biotin-λ-DNA kanıtlanmış bir toplu işlemle düşük olduğunda durumlarda DNA hayvan zinciri sırasında PEG functionalization ve streptavidin ve biotin-λ-DNA konsantrasyonları sırasında silane-PEG-biotin konsantrasyonları artırılması deneyin. Bu başarısız olursa, PEG ve streptavidin reaktifler değiştirin.
Sorun 3: DNA’lar coverslip için sopa bird akış tarafından uzatılmış olamaz.
Çözüm: PEG functionalization verimliliği düşük ve düşük tahlil pH tarafından ağırlaştırılmış olduğunda bu sorun da ortaya çıkabilir. Deneyin daha fazla BSA akan veya pH (örneğin 8,0 için) DNA adsorpsiyon (Adım 4.3.2) yüzeye bastırmak yardımcı yükselterek. DNA adsorpsiyon bir özel tahlil koşul altında kalıcı bir konudur, yukarıya sırasında PEG functionalization % 90 silane-PEG-COOH için dahil olmak üzere deneyin.
Veri Çözümleme Notları:
Biz takip yazılımı özel tek parçacık yörüngeleri tek moleküllerinin DNA üzerinden Difüzyon tanımlamada kullanmak hangi onların 1D Difüzyon sabitler, D1 tahmin edilmektedir. Veri Çözümleme geliştirmek için biz hayata parçacıklar ve önemli ölçüde veri analiz ödün vermeden hızlandırdı 1 D Difüzyon sabitler tahmin etmek için Kovaryans tabanlı Tahmincisi19 yerelleştirme için Radyal simetri algoritması18 doğruluk. Daha önce özel yazılım simüle veri11analiz ederek geçerliliği. Önemli adımları aşağıda açıklanmıştır.
Parçacık kimliği:
Bu tespit ve parçacıklar – kırınım-sınırlı noktalar – arka plan segmentlere için bir adımdır. İlk olarak, dağınık şekilde bant geçiren Filtre parçacıkların 3-5 (ki bizim sistemde noktası yayıldı fonksiyonu boyutunu karşılık gelir) piksel aralığı ve daha sonra üzerinde yoğunluk dayalı eşik sinyali artırmak için görüntüleri (komut dosyası bkz: spt2_SD_sandbox.m).
Centroid atama
Görüntü segmentlere yalnızca piksel düzeyinde Uzaysal çözünürlük moleküllerine yerelleştirir. Moleküller çok daha yüksek duyarlılığa yerelleştirmek için süper çözünürlüğü algoritması18 görüntülere filtre Radyal simetri yukarıdaki gibi istihdam. (Bu yöntem analitik bir hesaplamayı temel alır ve böylece büyük ölçüde 2D Gauss uydurma gibi diğer popüler yüksek doğruluk yöntemleri ile karşılaştırıldığında Hesaplamalı yükünü azaltır (komut dosyası bkz: spt2_SD_sandbox.m).)
Partikül: izleme
Çerçeveler arasında ilerlerken bir parçacık zaman yörüngesini izlemek için biz aynı parçacıkları yeniden tanımlamanız gerekir. Bileşenleri bir yörünge olarak başlatma, yanıp sönen ve fesih aşamaları göz önünde bulundurun. Bağlantı geçerli çerçeveler çerçeve başına izin verilen maksimum deplasman tarafından önceki çerçevelerde görünen bu parçacıkların sınırlamak. Birden çok bağlantıları nerede olası durumlarda, genel olarak en uygun bağlantı setleri vermeye Jonker-Volgenant algoritması kullanılır (komut dosyası bkz: traceTraj4_kx.3.m).
D1 tahmini:
Yörüngeler D1 değerleri tahmin etmek için Kovaryans tabanlı Tahmincisi (CVE)19kullanın. Analitik bir hesaplama üzerinde bağlı olarak, bu hesaplama açısından daha verimli bir yöntemdir ve istatistiksel olarak diğer daha sıkı sık kullanılan ortalama kare talebiyle gerileme gibi yöntemleri (komut dosyası bkz: runspt5_SD.m).
Yörünge filtreleme:
Bazı yörüngeleri bağlantı yüzey bağlı moleküllere gibi yapılar içeren ve kaldırılması gerekir. Biz birkaç şekil öyle aynı derecede en az öteleme paralel DNA, maksimum deplasman DNA, yörünge, olabildiğince az sayıda bağlantı tespit üçlüsü üst üste pozisyonlar ve (bkz: Xiong ark11 En düşük bir olasılık puanı en az uzunluğunu enine olarak hayata tanımı için) o filtre yörüngeleri Difüzyon üzerinde DNA molekülleri temsil etmek büyük olasılıkla en az önyargılı bir kümesini yalıtmak için (bkz: komut dosyası: sptViewFig2_update3x.m).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tony Kulesa, Robin Kirkpatrick ve Evangelos Gatzogiannis ilk Araçları Kurulum ve test ile yardım için teşekkür. Biz daha fazla yazma ve izleme yazılımı özelleştirilmiş tek parçacık değerlendirilmesi önemli yardım için Tony Kulesa teşekkür ederim. Bu eser başlangıç finansman ve Burroughs Wellcome Vakfı bilimsel arabiriminden (PCB için) bir kariyer Ödülü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Biotin labeled oligo, 5’-AGGTCGCCGCCC(A)20-biotin-3’ | IDT | Custom oligo synthesis | Standard desalting purification is sufficient |
| λ-DNA | New England Biolabs Inc. | N3011S | Make aliquots and minimize freeze-thaw cycle number |
| T4 DNA ligase and ligation reaction buffer | New England Biolabs Inc. | M0202S | |
| Amicon centrifugal filter tubes with NMWL of 100k Dalton | EMD Millipore | UFC510008 | |
| No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-106 | |
| Pure ethanol | VWR | 89125-186 | |
| Potassium hydroxide pellets | Fisher Scientific | P250-500 | |
| Plasma cleaner, model No. PDC-32G | Harrick Plasma | ||
| Silane-peg-biotin | Nanocs | PG2-BNSL-5k | Store at -20oC in dry nitrogen gas |
| A CAD software | Autodesk | AutoCAD | |
| Double-adhesive tape | Adhesive Applications | 8512-2-DP/DL | |
| Tape cutter, model No. CE5000-40-CRP | Graphtec America | ||
| PDMS and crosslink reagent kit | R.S. Hughes | RTV615 CLEAR 010 | |
| Degassing chamber, model No. F42010-0000 | BEL-ART Products | ||
| Mixer, model No. ARV-310 | Thinky | ||
| Hole puncher, Harris Uni-Cores, Size 0.5 mm | Harris Uni-Cores | This can be substituted with a manual biopsy punch with a similar needle size | |
| Tygon tubing | Cole Parmer | EW-06420-02 | 0.020" ID, 0.060"OD |
| Peek tubing | Western Analytical | PK007-031-Y | 0.007" ID, 0.031"OD |
| Streptavidin | New England Biolabs Inc. | N7021S | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs Inc. | B9000S | |
| Sytox orange nucleic acid stain | Invitrogen | S11368 | |
| Ti-E Microscope | Nikon | Microscope, camera, objective, dichroic mirror and bandpass filter can be substituted for similar equipment | |
| 100x Objective, NA/1.49, CFI Apo TIRF | Nikon | ||
| CMOS camera | Hammamatsu | Orca Flash 4.0 | |
| Dichroic mirror | Semrock | FF560/659-Di01-25×36 | |
| Bandpass filter | Semrock | FF560/659-Di01-25×36 | |
| 532 nm laser | Rayscience Innovation Limited, Shanghai | OEMLL-FN-532nm-C | Select wavelength to correspond to stain of choice |
| Syringe pump | Chemxy | Fusion 200 | |
| TMR-KRRR, >=85% purity | MIT Biopolymer lab | ||
| pVIc-Cy3B, HPLC purified | A gift from Dr. Walter Mangel at Brookhaven National lab | ||
| Script programming software | MathWorks | Matlab | |
| * see parts list for solenoid valves, computer interface, and assembly instructions at: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers |
References
- Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. 1. Models and theory. Biochemistry. 20, 6929-6948 (1981).
- Blainey, P. C., van Oijen, A. M., Banerjee, A., Verdine, G. L., Xie, X. S. A base-excision DNA-repair protein finds intrahelical lesion bases by fast sliding in contact with DNA. P Natl Acad Sci USA. 103, 5752-5757 (2006).
- Leith, J. S., et al. Sequence-dependent sliding kinetics of p53. P Natl Acad Sci USA. 109, 16552-16557 (2012).
- Blainey, P. C., et al. Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space IV. Viral proteinase slides along DNA to locate and process its substrates. J Biol Chem. 288, 2092-2102 (2013).
- Graziano, V., et al. Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space II. Adenovirus proteinase is activated in an unusual one-dimensional biochemical reaction. J Biol Chem. 288, 2068-2080 (2013).
- Graziano, V., et al. Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: I. binding to DNA and to hexon of the precursor to protein VI, pVI, of human adenovirus. J Biol Chem. 288, 2059-2067 (2013).
- Baniecki, M. L., McGrath, W. J., Mangel, W. F. Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: III. atomic resolution structure of the nascent form of the adenovirus proteinase. J Biol Chem. 288, 2081-2091 (2013).
- Kabata, H., et al. Visualization of single molecules of RNA polymerase sliding along DNA. Science. 262, 1561-1563 (1993).
- Harada, Y., et al. Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time. Biophysical journal. 76, 709-715 (1999).
- Mangel, W. F., McGrath, W. J., Xiong, K., Graziano, V., Blainey, P. C. "Molecular sled"- vehicle of 11-amino acids that facilitates biochemical interactions via sliding components along DNA. Nature Communications. , (2016).
- Xiong, K., Blainey, P. C. Molecular sled sequences are common in mammalian proteins. Nucleic Acids Res. 44, 2266-2273 (2016).
- Xiong, K., Erwin, G. S., Ansari, A. Z., Blainey, P. C. Sliding on DNA: from peptides to small molecules. Angew. Chem. Int. Ed. 55, 15110-15114 (2016).
- Turkin, A., et al. Speeding up biomolecular interactions by molecular sledding. Chem Sci. 7, 916-920 (2016).
- Zhang, L., Zheng, L., Meng, Z., Balinin, K., Loznik, M., Herrmann, ,. A. Accelerating chemical reactions by molecular sledding. Chem Commun (Camb). 47, 6331-6334 (2017).
- van Oijen, A. M., et al. Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder. Science. 301, 1235-1238 (2003).
- Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24, 10524-10531 (2008).
- Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., Oijen, A. M. V. Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay. J Vis. Expt. , e1689 (2010).
- Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nat Methods. 9, 724 (2012).
- Vestergaard, C. L., Blainey, P. C., Flyvbjerg, H. Optimal estimation of diffusion coefficients from single-particle trajectories. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 89, 022726 (2014).
- Schroeder, C. M., Blainey, P. C., Kim, S., Xie, X. S. . Hydrodynamic Flow-stretching Assay for Single-Molecule Studies of Nucleic Acid-Protein Interactions. , (2008).
- Blainey, P. C. . Single-Molecule Studies of Protein-DNA Interaction: Diffusive Search and Sequence-Dependent Motors. , (2007).
- Gorman, J., Greene, E. C. Visualizing one-dimensional diffusion of proteins along DNA. Nat Struct Mol Biol. 15, 768-774 (2008).
- Lin, Y. H., et al. Using the Bias from Flow to Elucidate Single DNA Repair Protein Sliding and Interactions with DNA. Biophysical journal. 96, 1911-1917 (2009).
- Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nat Struct Mol Biol. 16, 1224-1234 (2009).
- Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H., Schroeder, C. M. Direct observation of TALE protein dynamics reveals a two-state search mechanism. Nat Commun. 6, 7277 (2015).
- Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H. M., Schroeder, C. M. TALE proteins search DNA using a rotationally decoupled mechanism. Nat Chem Biol. 12, 831-837 (2016).
- Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57, 179-186 (2012).
- Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Method Enzymol. 472, 293-315 (2010).
