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Biochemistry

Una sola molécula Simple, robusto y alto rendimiento flujo estiramiento aplicación de análisis para el estudio de transporte de moléculas a lo largo de la DNA

Published: October 01, 2017
doi:
10.3791/55923
,
1Broad Institute,Massachusetts Institute of Technology and Harvard Medical School, 2Dept. of Biological Engineering,Massachusetts Institute of Technology

Summary

Este protocolo muestra un ensayo de extensión de flujo simple, robusto y alto rendimiento sola molécula para estudiar la difusión unidimensional de (1D) de moléculas de ADN.

Abstract

Se describe un ensayo de extensión de flujo simple, robusto y alto rendimiento sola molécula para el estudio de difusión de 1D de las moléculas a lo largo del ADN. En este ensayo, cubreobjetos de vidrio son funcionalizados en una reacción de un solo paso con silano-PEG-biotina. Células de flujo se construyen colocando una cinta adhesiva una vía corta entre un cubreobjetos funcionalizado y una losa PDMS que contiene los orificios de entrada y salida. Varios canales están integrados en un flujo y el flujo de reactivos en cada canal puede ser totalmente automatizado, que significativamente incrementa la capacidad de análisis y reduce el tiempo de práctica por ensayo. Dentro de cada canal, biotina-λ-DNAs son inmovilizadas en la superficie y se aplica un flujo laminar para flujo-tramo el DNAs. Las moléculas de ADN se estiran para > 80% de su longitud del contorno y servir como espacialmente extendida plantillas para estudiar la actividad vinculante y el transporte de moléculas fluorescencia marcadas. Las trayectorias de las moléculas individuales se realiza el seguimiento por imágenes de fluorescencia de reflexión interna Total (TIRF) lapso de tiempo. Imágenes RAW se analizan usando la sola partícula aerodinámico personalizado software de rastreo para automáticamente identificar trayectorias de las moléculas individuales que se difunde a lo largo de ADN y estimar sus constantes de difusión D 1.

Introduction

Un viejo problema en biología es proteínas cómo endógenas que actúan en específicos sitios en el genoma pueden localizar sus objetivos de ADN con la suficiente rapidez para el organismo sobrevivir y responder eficazmente a su entorno. Estudios en los últimos cuarenta años propusieron y ayuda en gran medida la hipótesis de que la cinética del ADN objetivo búsqueda por una proteína puede ser acelerada por facilitó la difusión en el cual la proteína alterna entre difusión 3D en la mayor parte y 1D difusión (incluyendo desplazamiento y salto de procesos) a lo largo del ADN1. Ahora se sabe que muchas proteínas implicadas en la regulación génica, metabolismo de ácidos nucleicos y otros procesos son capaces de deslizarse sobre ADN2,3,4,5,6,7 ,8,9. Además, estudios recientes informaron que incluso pequeños péptidos pueden enlazar y deslice sobre el ADN, con la capacidad para transportar una carga; por ejemplo, una molécula de proteína o cartilla de la polimerización en cadena, a lo largo de ADN10,11,12,13,14.

En los últimos 15 años, el ensayo de extensión de flujo sola molécula ha sido ampliamente utilizado para el estudio de enlace y difusión de las moléculas a lo largo de ADN2,15,16. En este tipo de análisis, las moléculas de ADN de doble hebra biotinilado se inmovilizan a la superficie y se aplica un flujo laminar a flujo estirar el ADN. El > 80% estirado DNAs sirven como plantillas espacialmente extendidas para el estudio de la actividad de enlace y transporte de moléculas con fluoróforos donde las trayectorias de las moléculas individuales a lo largo del ADN se realiza el seguimiento por imágenes por fluorescencia Time-lapse. En nuestra implementación, optimizado para la reproducibilidad y facilidad de uso, este ensayo consiste en cinco pasos principales: preparación de biotina-λ-DNA, funcionalización de cubreobjetos, construcción de celda de flujo, proyección de imagen de fluorescencia y análisis de datos. En anteriores protocolos17, cubreobjetos de vidrio fueron funcionalizados por primera trietoxisilano reaccionan con (3-aminopropil) (APTES) y luego con amina reactiva polietilenglicol (PEG) reactivos (por ejemplo, NHS-PEG-biotina) para formar una capa de PEG que resiste adsorción no específica de los componentes del ensayo a la superficie del cubreobjetos. La calidad de cubreobjetos funcionalizados dependía en gran medida la calidad de PEG reactivos y condiciones de reacción en cada paso. Nuestro protocolo describe un protocolo simplificado de funcionalización y multiplex flujo celular construcción requiere ningún pegamento líquido o tiempo de curado en las células de flujo del día están montados. También describimos datos ágil y robusto análisis procedimiento11 que elimina pasos de cálculo intensivo de regresión aplicando un simetría radial método centroide localización18 y una difusión basados en la covarianza estimador constante19.

Aquí, Divulgamos un simple, robusto y molécula única de alto rendimiento de flujo estiramiento aplicación de ensayo con mejoras significativas en la funcionalización de cubreobjetos, construcción de celda de flujo y análisis de datos. En particular, hemos desarrollado un protocolo de funcionalización cubreobjetos un paso, en el cual cubreobjetos limpio y secos reaccionan directamente con silano-PEG-biotina. Este Protocolo simplifica la preparación del cubreobjetos y mejora la fiabilidad de la calidad de las superficies functionalized comparado con el protocolo de reacción de dos etapas estándar. Describimos el uso de cubreobjetos para funcionalizados con células de caudalómetro PDMS multicanales que permiten las conexiones de la tubería sólida sin pegamento. Estas células de flujo adicional incluyen múltiples entradas controladas por ordenador para cada cámara de flujo que permiten el flujo de reactivos automatizado reducir el tiempo de práctica durante el ensayo de mayor rendimiento y configuración.

Protocol

1. preparación de biotina-λ-DNA Nota: las moléculas de biotina-λ-ADN son preparadas por la ligadura de un oligonucleótido marcado con biotina, 5 '-AGGTCGCCGCCC(A) 20 – biotina – 3 ' para Λ-DNA moléculas 20. Biotina 0.1 mM de preparar etiquetado oligo en buffer TE. Valores de λ DNA 0.5 mg/mL de calor a 65 ° C durante 60 s y penetración en el hielo húmedo inmediato. Nota: Apaga rápido enfriamiento reduce λ DNA concatemerization. Pipeta 100 μl de la solución λ DNA en un tubo de microcentrífuga. Añadir 1 μl de la oligo de 0,1 mM en 9 μl de tampón TE. Añadir 2 μl de la solución de oligo al tubo de microcentrífuga que contiene el ADN de λ. Mezclar muy bien. Nota: Oligo está presente en aproximadamente un exceso molar 12-fold en el extremo de ADN complementario de λ. La mezcla DNA/λ-oligo a 65 ° C por 60 s. Enfriar lentamente la mezcla a temperatura ambiente. Nota: Este paso permite el oligo a Recueza hasta el final de ADN complementario de λ. Coloque la mezcla en hielo. Añadir 11 μl de tampón de reacción de ligasa de T4 ADN (concentración final tampón 1 x). Mezclar suavemente. Luego añadir 2 μl (800 unidades) de la enzima de T4 ADN ligasa. Mezcle suavemente. Incubar la mezcla por 2 h a 16 ° C o durante la noche a 4 ° C. Purificar el producto usando los tubos del filtro centrífugo con un límite de peso molecular nominal de 100 kDa. Específicamente, la mezcla paso 1.9 la transferencia a un filtro centrífugo tubo y centrifugar a 14.000 x g durante 5 minutos, lave con 400 μL de tampón TE dos veces y recoger el producto purificado. Nota: Las purificada como biotina-λ-DNAs en tampón TE son estables a-20 ° C hasta por un año. 2. Funcionalización de cubreobjetos Nota: vidrio cubreobjetos son funcionalizados por reaccionar con silano-PEG-biotina. Este protocolo de reacción de un solo paso es más sencillo y más fiable en nuestra experiencia que la reacción de dos etapas estándar protocolo 20. Funcionalización de cubreobjetos con silano-PEG-biotina crea sitios de Unión para estreptavidina y minimiza la DNA no específica y adsorción de la proteína a la superficie del cubreobjetos. Someter a ultrasonido cinco Nº 1 cubreobjetos en etanol al 95% dentro de una tinción tarro durante 10 minutos y luego enjuague con agua ultrapura para tres veces. Nota: El cubreobjetos Quinta ofrece un repuesto en caso de rotura. Llenar la jarra de tinción con KOH de 1 M, someter a ultrasonidos durante 10 minutos y luego enjuague con agua ultrapura tres veces. Repetir dos veces el ciclo de 2.1-2.2. Secar el cubreobjetos bajo flujo de gas de 2 N seco y limpio. Más limpio y seco el cubreobjetos aplicando tratamiento de plasma de aire a presión mTorr 900 por 5 min Incubar cubreobjetos con silano-peg-biotina 25 mg/mL disuelta en etanol de 95% a temperatura ambiente durante 2 h. específicamente, sandwich 50 solución de silano-peg-biotina μl entre dos cubreobjetos limpio y secos e incubar el cubreobjetos " bocadillos " dentro de una caja de punta de pipeta cerrada con unos 10 mL de agua en la parte inferior (no en contacto con el cubreobjetos) para minimizar la evaporación de disolventes. Lavar exceso moléculas de PEG con agua ultrapura y seque la clavija cubierta cubreobjetos en limpio en seco el flujo de gas N 2. Nota: El cubreobjetos funcionalizados pueden guardarse tres días bajo condiciones de ambiente. 3. Construcción de celda de flujo Nota: las células de flujo se construyen colocando una cinta adhesiva de doble vía corta entre una PEG funcionalizados cubreobjetos y una losa PDMS que contiene los orificios de entrada y salida. Varios canales están integrados por la célula de flujo. Canales de flujo en un software CAD de diseño y corte de los canales (la anchura, profundidad y longitud de cada uno de los canales son 1, 0.13 y 12 mm, respectivamente) en una cinta de doble adhesivo usando un cortador de cinta (típicamente ocho canales están integrados por la célula de flujo). Eliminar residuos de cinta para formar los canales de flujo. Para hacer losas PDMS, mezclar bien 45 g de PDMS con 5 g de reactivo de reticulación (suficiente para hacer doce losas situados con grueso de 5 mm que pueden ser almacenadas indefinidamente bajo condiciones ambientales) con un mezclador, vierta la mezcla en dos platos de Petri de 10 cm y dejar el platos dentro de una cámara de vacío hasta que esencialmente todas las burbujas de aire desaparecen (manualmente eliminar burbujas de aire si alguno se mantienen cuando los platos se retiran de la cámara de vacío). Entonces transfiera los platos en un horno de 80 ° C hasta que solidifica de PDMS (aproximadamente 2 h). Cortar una losa PDMS que coincida con el tamaño de la cinta adhesiva de doble vía corta. Cáscara de protección una película fuera de la cinta adhesiva doble y adherir la película a una cara plana de la losa PDMS. Perfore los orificios de entrada y salida de la losa PDMS con un puncher de agujero de biopsia con una aguja de calibre 23. Pela la segunda película de la protección de la cinta adhesiva doble y se adhieren a la Asamblea de PDMS-cinta a la superficie funcionalizada del cubreobjetos (Asegúrese de que el cubreobjetos esté plano. Ver una foto de una celda de flujo completamente montado en la Figura 1a). 4. TIRF Imaging Nota: biotina-λ-DNAs son atados a una superficie de canal de flujo y de flujo laminar se aplica al flujo de estiramiento las moléculas de ADN ( Figura 1b). El > 80% estirado sirven de moléculas de ADN como espacialmente extendidas plantillas para observar la actividad vinculante y el transporte de moléculas fluorescencia marcadas. Las trayectorias de las moléculas individuales son rastreadas por proyección de imagen de Time-lapse TIRF ( figura 1 c & e). Solución de estreptavidina fijar la celda de flujo en un microscopio etapa y carga previamente desgasificada en blanco tampón (fosfato de sodio 10 mM, 2 mM NaCl, 50 μm EDTA, etanol de 20 mM, 5% (v/v) de glicerol, 0,01% Tween-20, 1% (v/v) β-mercaptoetanol, pH 7.4), 0,2 mg/mL, 1 mg / mL de solución de albúmina de suero bovino (BSA) y solución de biotina-λ-DNA de 100 pM en cuatro reservorios que cada uno tienen una tubería de Tygon conectado a un valor de solenoide y otra tubería de Tygon conectadas a una tubería de la ojeada por envolver la tubería de Tygon sobre el menor (tubería de PEEK evita el reflujo de reactivos). Pequeños volúmenes de tampón de Degas por la exposición al vacío o menor exposición al vacío con agitación (hasta que las burbujas no son visibles). Inserte la tubería de la OJEADA del depósito tampón en blanco el orificio de una entrada de la célula de flujo. Cebe el canal que fluye en buffer en blanco e inserte tres otros tubos de la OJEADA de orificios de entrada la presión de aire por flujo de cada reactivo es controlada por válvulas de solenoide y totalmente automatizada mediante un script de ordenador. Tenga cuidado de no inducir la formación de burbujas de aire en el canal. Conectar una tubería de Tygon con un corto tubo de ojeada desde el orificio de salida a un contenedor de residuos. El tubo corto de PEEK en la salida ayuda a suprimir la formación de burbujas de aire durante la infusión por manteniendo una presión positiva dentro del canal. Inmovilización de moléculas de biotina-λ-ADN a una superficie de flujo canal. Flujo en 0,2 mg/mL de solución de estreptavidina, incubar por 5 min y luego flujo en búfer blanco para lavar la estreptavidina. Flujo en solución 1 mg/mL BSA, incubar durante 1 minuto y entonces fluyen en búfer blanco para lavar la BSA. Nota: BSA más suprime el ADN y la adsorción de la muestra a la superficie. Flujo en solución de biotina-λ-ADN pM 100, incubar por 10 min y luego flujo en búfer blanco para lavar las DNAs. Nota: Después de que el ADN está enlazado a la superficie, evitar flujos rápidos para evitar daños en las moléculas de ADN ancladas. Para comprobar la calidad del cubreobjetos funcionalizado, flujo en el ADN de tinte como Sytox la coloración naranja en las condiciones de ensayo a utilizar (leído 4.6 abajo) y empezar a fluorescencia bajo 532 nm láser la iluminación de la imagen. Nota: La calidad del cubreobjetos funcionalizado es generalmente buena y la densidad de las moléculas de ADN de flujo estirada será alta. Es esencial tener una densidad suficiente de moléculas de ADN de flujo estirado para que pueden observarse deslizamiento / 1D difusión eventos y atascamiento de la DNA. Bellas ajustar el ángulo de la TIRF para lograr mejor relación señal a ruido de imágenes de moléculas de ADN se extendía ( figura 1 d). Para registrar las trayectorias de las moléculas individuales moviéndose a lo largo del ADN, dentro de un nuevo canal repita 4.2-4.4 (sin DNA tinción colorante), a continuación, infundir previamente desgasificada sub-nanomolar fluoróforo etiquetado moléculas con un caudal lo suficientemente alta mediante una bomba de jeringa y recoger imágenes de fluorescencia Time-lapse con una velocidad de 100 Hz. Nota: Una tasa de flujo equivalente a un número de Weissenberg (Wi: el producto sin dimensiones del mayor tiempo de relajación del polímero – aproximadamente 0,2 s para λ-ADN – y la tasa de corte – el cambio en la velocidad de flujo con la distancia de la superficie del cubreobjetos) de 500 dentro de la canal recomendado para la proyección de imagen de una molécula con una velocidad de 100 Hz 21. Recoger 10.000 marcos en un campo de visión (FOV) para producir una película y recopilar películas similares de varios campo de imagen (normalmente 10) por ejemplo. Nota: La densidad de partículas individuales en un campo de visión debe ser ni demasiado alto – que complicará el análisis de los datos haciendo asignación objeto en marcos ambiguos, ni demasiado bajos – que podría conducir a la baja ocurrencia de eventos sola molécula de ADN. Optimizar la intensidad de la iluminación para que las moléculas a la superficie del cubreobjetos son foto-blanqueado rápidamente para suprimir el fondo mientras que moléculas de difusión sobre el ADN no se blanquean demasiado rápido por lo que pueden ser detectados trayectorias más. Nota: Normalmente utilizamos densidad de potencia de 200-800 W/cm 2 en el FOV. Al final del paso 4.6, infundir ADN tinción colorante para confirmar que las moléculas de ADN todavía pueden ser estirada de flujo. Ejecutar ambas muestras de control positivo y negativo. Nota: Un buen control positivo es un tetrapéptido, TetraMethylRhodamine (TMR)-KRRR (TMR es acoplada a la amina del N-terminal) que tiene una constante de difusión D 1 media de 10,5 ± 0.7 (error estándar) M (bp 2/s) en pH neutro 11. Un buen control negativo es medir marcadas muestras de interés en tampon de ensayo en un canal que no tiene ninguna DNA atada, donde no se debe detectar ninguna actividad de difusión en ADN. 5. Análisis de datos: Nota: se utiliza una sola partícula personalizada software de rastreo para identificar trayectorias de las moléculas individuales que se difunde a lo largo de la DNA y calcular constantes de difusión. Este software determina primero la posición del centroide de solas partículas con alta exactitud, identifica las partículas que se pegan en la superficie del cubreobjetos y luego une las partículas en diferentes marcos para formar trayectorias de Time-lapse. De estas trayectorias, se estimaron que las constantes de difusión D 1. Para iniciar el análisis de datos, abrir un software de scripting (véase tabla de materiales) y vaya al directorio de la partícula individual el software de seguimiento. Abrir el script llamado " largedataprocess3.m ". Un parámetro importante a definir es el valor de umbral para detección de partículas solo. Ejecute para determinar el valor umbral óptimo, el " Determine_threshold_value.m " secuencia de comandos. Este script indica cómo el valor de umbral afecta la detección de partículas individuales. Después de determinar el valor de umbral óptimo, el " largedataprocess3.m " texto Después de la terminación de la sola partícula seguimiento análisis, filtrar las trayectorias crudas mediante la ejecución de la " Trajectory_filtering.m " secuencia de comandos. Una interfaz gráfica de usuario (GUI) se construye en visualizar el filtrado paso. Panel de en la interfaz gráfica de usuario, establece el desplazamiento mínimo a lo largo de la DNA, MinXDisp, en 2 píxeles, establece el máximo desplazamiento transversal ADN, MaxYDisp, en 2 píxeles establece el número mínimo de fotogramas, minFrames, a 10; establece el número mínimo de Estados del trío, minTriplets, en 10; Establezca la constante de difusión mínima a lo largo de la DNA, D_par, 0; se establece la constante de difusión estimada máxima transversal en ADN, D_trans, para 10 M (PB 2) S -1; establecer el parámetro de estadística mínima, _stat de Chi 2, a -5; establece la relación mínima de desplazamiento a lo largo del ADN en que transversal ADN, MinX/Y, 2. Nota: Todos trayectorias crudas que pasan estos parámetros de filtrado se enumeran en la tabla 1, y los que no figuran en la tabla 3. Haga clic en una trayectoria de número en la tabla 1, la trayectoria se desplazará en la gráfica 1 & 2. Haga clic en el " Play " el botón para reproducir las imágenes crudas de la fluorescencia. Haga clic en el " Add_to_Table2 " para identificar la trayectoria como una sola molécula trayectoria de desplazamiento. Al final, todas las trayectorias a Table2 se guardarán al cerrar el GUI. Para calcular las constantes de difusión media, ejecutar el script " Calculate_mean_diffusion_constant.m ". Calcula la constante de difusión media del conjunto de trayectorias que han pasado todos los pasos de filtrado y se ha añadido a la tabla 2.

Representative Results

Figura 2a muestra las trayectorias detectadas de Cy3B pVIc (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B es conjugado con el residuo de cisteína) moléculas de difusión sobre el ADN de 2 mM NaCl buffer a pH 6.5. La difusión del pVIc es bidireccional e impulsada por energía térmica ambiente. De estas trayectorias, las constantes de difusión de 1D (valores de D1) se calcula para cada trayectoria (ver el histograma en la figura 2b). La media valor de D1 de este conjugado pVIc es calculada 22.2 ± 0.9 (error estándar) M (bp2/s) por un promedio de cada valor de D1 a través de trayectorias ponderados por el número de tripletes consecutivos posición llamadas contenidas en cada trayectoria. Figura 1 : Aparato para el seguimiento de movimiento de las moléculas individuales a lo largo del ADN.un) un PDMS de ocho canales chip microfluídico adherido a un cubreobjetos funcionalizado que ADN puede ser atado (con moneda de cuarto de Estados Unidos para la escala); b) flujo esquemático de zoom celular mostrando las moléculas de ADN λ se extendía el flujo; c) esquema de sistema de microscopio y flujo TIRF para estirar el ADN; d) imagen TIRF de un estirada de flujo λ ADN; e) imagen TIRF de Cy3B pVIc (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B es conjugado con el residuo de cisteína) moléculas enlazado a una estirada de flujo λ DNA. Esta figura se ha modificado con permiso2,12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2 : Difusión unidimensional del pVIc (GVQSLKRRRCF) a lo largo del ADN.a). difusión del pVIc por flujo estirado λ-DNAs (137 trayectorias) en 2 mM de tampón con NaCl a pH 6.5. x (t) y y (t) son los desplazamientos a lo largo y transversal λ-ADN, respectivamente. Líneas horizontales punteadas indican los puntos que falta resultante de tinte parpadeando. b). histograma de la constante de difusión, D1 para pVIc difundiendo a lo largo de la λ-DNAs. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Al cambiar el protocolo de reacción de dos etapas tradicionales cubreobjetos funcionalización a un protocolo de reacción de un solo paso, nos dimos cuenta de que se mejoró significativamente la fiabilidad de la funcionalización del cubreobjetos. Como el tiempo total de prácticas para la preparación de cubreobjetos es menos de treinta minutos, se recomienda preparar cubreobjetos fresco cada día sola molécula la proyección de imagen está previsto. Para minimizar el deterioro de silano-PEG-biotina, el reactivo debe ser alícuotas y almacenados bajo seco N2 de gas a-20 ° C a la recepción. Aquí no utilizamos moléculas de PEG que producen -COO– o -CH3 grupos terminales que se han utilizado en los últimos20. Las cargas negativas de -CH3 grupos hidrofóbicos y grupos -COO– fueron utilizadas para evitar la adsorción inespecífica de las moléculas de ADN y muestras de la proteína específica a la superficie, respectivamente. Observamos muy baja adsorción superficial de muestras pequeño péptido en la superficie de PEG completamente terminada en biotina, silano-PEG-COOH o silano-PEG-CH3 podría ser útil para los análisis de ciertas muestras de proteína o cuando las condiciones del análisis (como pH < 7.5) promover las interacciones DNA-superficie.

El cambio de células de caudalómetro de portaobjetos de vidrio a PDMS flujo acelera la construcción de la célula de flujo de las células y permite la fácil integración de múltiples canales. A menudo nos Ingeniero ocho canales por la célula de flujo para permitir ocho experimentos independientes por cubreobjetos funcionalizados. Para aumentar aún más el rendimiento por cubreobjetos, podría utilizarse un número aún mayor de fabricado de micro canales.

Es recomendable para prevenir la formación de burbujas de aire dentro del canal en cualquier momento después del llenado inicial. Generalmente, las burbujas de aire no causan pérdida de DNAs tethered (aunque esto es posible), pero más bien interrumpir el flujo y provocar DNAs se adhiera al cubreobjetos. Buffer de desgasificación y la adición de cantidades pequeñas de surfactante son normalmente eficaces en la prevención de la formación de burbujas dentro del canal de flujo y tubería. En los casos donde se introducen burbujas de aire a la tubería, tratar de eliminar las burbujas bajo un flujo lento y asegúrese de que no fluyen a través de la región donde están amarrados los DNAs.

Un software de análisis de datos simplificada y eficiente es crítico, debido a la gran cantidad de datos generados. Generalmente obtenemos 700.000 imágenes de alta resolución de las mediciones en la célula de un flujo, que puede ser procesada con nuestra sola partícula personalizado seguimiento de software dentro de un día en una computadora de escritorio con un quad-core procesador y 32 Gb de memoria. El índice de falsos positivos de detección de trayectorias de difusión D 1 por el software (paso 5.5) es dependiente de la muestra y puede ser bastante bajo teniendo en cuenta que: 1) la densidad de las partículas individuales en el campo de visión es lo suficientemente baja como para que haya ambigüedad poco a las partículas a través de marcos ( muestras de proteínas en general son más propensas a la adsorción inespecífica en el cubreobjetos que muestras de péptido, y así, el buffer y la densidad de energía para cada proteína de la muestra necesita ser optimizado); 2) la relación señal a ruido de partículas individuales es lo suficientemente alta como para que la probabilidad de falsa identificación de partículas es baja. Aún así, el software puede cometer errores ocasionales, y recomendamos inspección manual de los datos usando la GUI proporcionada para evaluar el desempeño del software. En una aplicación particularmente sensible a la detección de trayectoria de falsos positivos, se pueden establecer parámetros de proceso incluyendo el valor de umbral, minFrames, minTriplets y Chi2_stat más rigurosamente a costa de menor sensibilidad para el verdadero enlace eventos y potencialmente mayor sesgo estadístico en la identificación de la trayectoria. Aquí compartimos y describir nuestra sola partícula software con la esperanza de ayudar a estandarizar los métodos de análisis de datos y estimular el debate sobre las mejores prácticas de seguimiento.

En nuestro protocolo, que requiere un flujo continuo durante la proyección de imagen para mantener el estado estirado de las moléculas de la plantilla de ADN, el fluido podría sesgar el transporte de algunas proteínas a lo largo de plantillas de la DNA si difunden por un mecanismo de salto o si la hidrodinámica radio de etiquetado fluoróforo es grande22,23. Mientras que tal sesgo puede ser medida y corregida en la mayoría de bases de datos, el transporte de proteínas marcado con un fluoróforo pequeño y difusión por un mecanismo de desplazamiento no es típicamente sesgado de manera perceptible por flujo2,4, 24. En particular, el impacto de la velocidad del flujo en el transporte de proteínas a lo largo de la DNA se ha utilizado para estudiar los mecanismos de la proteína difunde a lo largo de ADN23. A estrechamente relacionados con el enfoque alternativo que permite las mediciones en la ausencia de flujo utiliza plantillas de la DNA con la biotina en ambos termini que transitoriamente se estiran en flujo y atados por ambos extremos para el cubreobjetos de tal que las moléculas de ADN siendo en un configuración extendida cuando la corriente se apaga25,26,27,28. El enfoque de doble anclaje tiene la ventaja de permitir experimentos de transporte libres de corriente pero requiere modificar ambos extremos de las moléculas de la plantilla de ADN, control de flujo cuidadoso durante la inmovilización y caracterizar las distancias entre los dos sitios de anclado. Además, debe evaluarse el impacto de las tensiones heterogéneas y dinámica conformacional de DNA a través de las moléculas de ADN en el ensayo de una sola molécula.

En conjunto, además de estudiar la difusión de 1 D de las moléculas a lo largo de la DNA, el análisis divulgado como sola molécula pueden beneficiarse muchos en vitro bioquímicos y biofísicos estudios en el nivel de molécula única incluyendo ADN objetivo procesos de búsqueda por proteínas, actividades enzimáticas en la DNA y más.

Solución de problemas

Problema 1: Los canales de flujo de fuga.

Solución: Primero, asegúrese que el diseño de canales de flujo permite al menos 1,5 margen mm para el sellado alrededor y entre los canales; y luego, durante el montaje de la célula de flujo, asegúrese de que las superficies de contacto entre el cubreobjetos, la cinta adhesiva doble y la losa PDMS son plana, seca y libre de escombros, que la presión aplicada para formar el sello es uniforme, y que la operación de sellado es realizan a temperatura ambiente.

Problema 2: La densidad de DNAs tethered es demasiado baja.

Solución: Este problema se presenta cuando la eficiencia de la funcionalización de PEG es baja o las moléculas de ADN no son funcionalizadas con biotina. Desde nuestra experiencia, la densidad del ADN atado debe ser alta para > el 90% de los cubreobjetos preparado de fresco o almacenado correctamente reactivos silano-PEG-biotina. En casos cuando la densidad del ADN anclado es baja con una hornada probada de biotina-λ-DNA, tratan de impulsar la concentración de silano-PEG-biotina durante la PEG funcionalización y concentraciones de estreptavidina y biotina-λ-ADN durante la inmovilización de ADN. Si esto no funciona, sustituir los reactivos PEG y estreptavidina.

Problema 3: DNAs ponerte el cubreobjetos de unad no puede ser estirado por flujo.

Solución: Este problema también puede surgir cuando la eficiencia de la funcionalización de PEG es baja y se agrava por pH bajo ensayo. Intento fluir en BSA más o subir el pH (por ejemplo, a 8.0) para ayudar a suprimir la adsorción del ADN a la superficie (paso 4.3.2). Si adsorción del ADN es un tema persistente bajo una condición particular del ensayo, probar incluyendo hasta 90% silano-PEG-COOH en PEG funcionalización.

Notas de análisis de datos:

Utilizamos encargo sola partícula software de rastreo para identificar las trayectorias de las moléculas individuales que se difunde a lo largo de ADN, de que se estiman que sus constantes de difusión de 1D, D1. Para mejorar el análisis de los datos, hemos implementado el algoritmo de simetría radial18 para la localización de las partículas y el estimador basado en la covarianza19 para estimar constantes de difusión D 1, que acelera notablemente análisis de datos sin comprometer la exactitud. Nosotros previamente validado el software personalizado mediante el análisis de datos simulados11. A continuación se describen los pasos principales.

Identificación de la partícula:

Este paso es para la detección y segmentación de partículas, manchas de difracción limitada – de fondo. En primer lugar, band-pass filtro espacial las imágenes para mejorar la señal de partículas en el 3-5 rango de píxeles (que corresponde al tamaño de la función de punto de propagación en nuestro sistema) y luego umbral basado en la intensidad (ver secuencia de comandos: spt2_SD_sandbox.m).

Asignación de centroide

Segmentación de la imagen sólo localiza las moléculas a nivel de píxeles de resolución espacial. Para localizar las moléculas mucho mayor precisión, emplean la simetría Radial Súper óón algoritmo18 imágenes filtradas que el anterior. (Este método se basa en un cálculo analítico y por lo tanto reduce enormemente carga computacional en comparación con otros métodos populares de alta precisión como ajuste gaussiano 2D (ver secuencia de comandos: spt2_SD_sandbox.m).)

Rastreo de partículas:

Para seguir la trayectoria de una partícula a través del tiempo, re-debemos identificar las partículas del mismo mientras se mueven entre bastidores. Consideramos las etapas de iniciación, parpadear y terminación que los componentes de una trayectoria. Restringir el acoplamiento de las partículas en los marcos actuales a los que aparecen en cuadros anteriores por el desplazamiento máximo permitido por el marco. En los casos donde son posibles los vínculos múltiples, se utiliza el algoritmo de Jonker Volgenant ceder globalmente óptimo acoplamiento de sistemas (ver secuencia de comandos: traceTraj4_kx.3.m).

Estimación de D1:

Para estimar valores de D1 de trayectorias, utilizamos el estimador basado en la covarianza (CVE)19. Basado en un cálculo analítico, este método es más de cómputo eficiente y estadísticamente riguroso que otros utiliza métodos como la regresión de la media cuadradas desplazamientos (ver secuencia de comandos: runspt5_SD.m).

Trayectoria de filtración:

Algunas trayectorias contienen artefactos tales como acoplamiento a moléculas de superficie-limita y deben eliminarse. Hemos implementado varias características como mínimo desplazamiento paralelo ADN, desplazamiento máximo transversal ADN, longitud mínima de trayectoria, el número mínimo de posiciones tripletes consecutivos detectados y puntuación mínima probabilidad (ver Xiong et al11 para la definición) que pueden ser filtradas para aislar un conjunto mínimamente tendencioso de las trayectorias que representan moléculas de difusión sobre el ADN (ver secuencia de comandos: sptViewFig2_update3x.m).

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Tony Kulesa, Robin Kirkpatrick y Evangelos Gatzogiannis para obtener ayuda con la configuración inicial de instrumentación y prueba. Más agradecemos Tony Kulesa ayuda significativa de la escritura y evaluación de la sola partícula personalizada software de seguimiento. Este trabajo fue apoyado por fondos de arranque y un premio de carrera en la científica interfaz (PCB) de la Burroughs Wellcome Foundation.

Materials

Biotin labeled oligo, 5’-AGGTCGCCGCCC(A)20-biotin-3’ IDT Custom oligo synthesis Standard desalting purification is sufficient
λ-DNA New England Biolabs Inc. N3011S Make aliquots and minimize freeze-thaw cycle number
T4 DNA ligase and ligation reaction buffer New England Biolabs Inc. M0202S
Amicon centrifugal filter tubes with NMWL of 100k Dalton EMD Millipore UFC510008
No. 1 glass coverslips VWR 48393-106
Pure ethanol VWR 89125-186
Potassium hydroxide pellets Fisher Scientific P250-500
Plasma cleaner, model No. PDC-32G Harrick Plasma
Silane-peg-biotin Nanocs PG2-BNSL-5k Store at -20oC in dry nitrogen gas
A CAD software Autodesk AutoCAD
Double-adhesive tape Adhesive Applications 8512-2-DP/DL
Tape cutter, model No. CE5000-40-CRP Graphtec America
PDMS and crosslink reagent kit R.S. Hughes RTV615 CLEAR 010
Degassing chamber, model No. F42010-0000 BEL-ART Products
Mixer, model No. ARV-310 Thinky
Hole puncher, Harris Uni-Cores, Size 0.5 mm Harris Uni-Cores This can be substituted with a manual biopsy punch with a similar needle size
Tygon tubing Cole Parmer EW-06420-02 0.020" ID, 0.060"OD
Peek tubing Western Analytical PK007-031-Y 0.007" ID, 0.031"OD
Streptavidin New England Biolabs Inc. N7021S
Bovine serum albumin (BSA) New England Biolabs Inc. B9000S
Sytox orange nucleic acid stain Invitrogen S11368
Ti-E Microscope Nikon Microscope, camera, objective, dichroic mirror and bandpass filter can be substituted for similar equipment
100x Objective, NA/1.49, CFI Apo TIRF Nikon
CMOS camera Hammamatsu Orca Flash 4.0
Dichroic mirror Semrock FF560/659-Di01-25×36
Bandpass filter Semrock FF560/659-Di01-25×36
532 nm laser Rayscience Innovation Limited, Shanghai OEMLL-FN-532nm-C Select wavelength to correspond to stain of choice
Syringe pump Chemxy Fusion 200
TMR-KRRR, >=85% purity MIT Biopolymer lab
pVIc-Cy3B, HPLC purified A gift from Dr. Walter Mangel at Brookhaven National lab
Script programming software MathWorks Matlab
* see parts list for solenoid valves, computer interface, and assembly instructions at: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers
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References

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Single MoleculeFlow Stretching AssayDNA TransportBiotin-labeled Lambda-DNAPEG Functionalized CoverslipsHigh Throughput Flow CellTIRF ImagingSingle Particle Tracking

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Xiong, K., Blainey, P. C. A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA. J. Vis. Exp. (128), e55923, doi:10.3791/55923 (2017).
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