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Biochemistry

Uma molécula simples, robusto e alta taxa de transferência de fluxo alongamento do ensaio implementação para estudar o transporte de moléculas ao longo de DNA

Published: October 01, 2017
doi:
10.3791/55923
,
1Broad Institute,Massachusetts Institute of Technology and Harvard Medical School, 2Dept. of Biological Engineering,Massachusetts Institute of Technology

Summary

Este protocolo demonstra um ensaio de alongamento de fluxo única molécula simples, robusta e de alta taxa de transferência para estudar a difusão unidimensional (1D) moléculas ao longo do DNA.

Abstract

Descrevemos um ensaio de alongamento de fluxo única molécula simples, robusta e de alta taxa de transferência para estudar a difusão 1D de moléculas ao longo do DNA. Neste ensaio, as lamelas de vidro são acrescidas em uma reação de uma etapa com silano-PEG-biotina. Células de fluxo são construídas pela imprensa uma fita adesiva com canais pre-cortadas entre uma lamela funcionalizada e uma laje PDMS contendo orifícios de entrada e saída. Vários canais estão integrados na pilha de um fluxo e o fluxo dos reagentes em cada canal pode ser totalmente automatizado, que significativamente aumenta o throughput de ensaio e reduz o tempo de hands-on por ensaio. Dentro de cada canal, biotina-λ-DNAs são imobilizadas na superfície e um fluxo laminar é aplicado para fluxo-esticar os DNAs. As moléculas de DNA são esticadas para > 80% do seu comprimento de contorno e servir como espacialmente estendidos modelos para estudar a atividade de ligação e transporte de moléculas fluorescente etiquetadas. As trajetórias de moléculas simples são controladas por lapso de tempo de imagem Total da fluorescência de reflexão interna (TIRF). Imagens RAW são analisadas usando simplificada personalizada única partícula que segue o software automaticamente identificar trajetórias de moléculas simples difusão ao longo do DNA e estimar suas constantes de difusão 1D.

Introduction

Um problema de longa data em biologia é proteínas como endógenas que atuam em específicas sites no genoma podem localizar seus alvos de DNA rápido o suficiente para o organismo sobreviver e responder de forma eficaz ao seu ambiente. Estudos nos últimos quarenta anos proposto e em grande medida de apoio a hipótese de que a cinética de DNA alvo busca por uma proteína pode ser acelerada por facilitou a difusão, em que a proteína alterna entre difusão 3D a granel e difusão 1D (incluindo deslizamento e pulando processos) ao longo do DNA1. Agora sabe-se que muitas proteínas envolvidas na regulação gênica, metabolismo de ácidos nucleicos e outros processos são capazes de deslizar em DNA2,3,4,5,,67 ,8,9. Além disso, estudos recentes relataram que mesmo pequenos peptídeos podem vincular e deslize no DNA, com a capacidade de transportar uma carga; por exemplo, uma molécula de proteína ou PCR primer, ao longo de DNA10,11,12,13,14.

Nos últimos 15 anos, o ensaio de alongamento de fluxo única molécula foi amplamente utilizado para estudar a ligação e a difusão de moléculas ao longo de15,2,DNA16. Neste tipo de ensaio, moléculas de DNA dupla-hélice biotinylated são imobilizadas para a superfície e um fluxo laminar é aplicado ao fluxo de esticar o DNA. O > 80% esticada DNAs servir como modelos espacialmente estendidos para estudar a atividade de ligação e transporte de moléculas rotulado com fluorophores onde as trajetórias de moléculas simples ao longo do DNA são controladas pela imagem latente de fluorescência de lapso de tempo. Na nossa implementação, otimizada para reprodutibilidade e facilidade de uso, este ensaio consiste em cinco etapas principais: preparação de biotina-λ-DNA, lamela functionalization, construção de célula de fluxo, imagem latente de fluorescência e análise de dados. Em anteriores protocolos17, as lamelas de vidro foram acrescidas pela primeira reação com (3-aminopropil) triethoxysilane (APTES) e, em seguida, com reagentes de amina reativos polietileno glicol (PEG) (por exemplo, NHS-PEG-biotina) para formar uma camada de PEG que resiste adsorção não específica de componentes de ensaio à superfície da lamela. A qualidade de lamelas funcionalizadas dependia em grande parte a qualidade dos reagentes de PEG e condições de reação em cada etapa. Nosso protocolo descreve um protocolo simplificado functionalization e construção de célula de fluxo multiplex que exige nenhum adesivo líquido ou tempo de cura sobre as células de fluxo do dia são montados. Também descrevemos uma simplificada e robusto de dados análise procedimento11 que elimina etapas computacionais regressão através da aplicação de um método de simetria radial de centroide localização18 e uma difusão baseados em covariância estimador constante19.

Aqui, nós relatamos um simples, robusto, e a única molécula alto throughput fluxo alongamento implementação de ensaio com significativas melhorias feitas em lamela functionalization, construção de célula de fluxo e análise de dados. Em particular, desenvolvemos um protocolo functionalization lamela de uma etapa, em que as lamelas de limpo e secas reagem diretamente com silano-PEG-biotina. Este protocolo simplifica a preparação da lamela e melhora a confiabilidade da qualidade de superfícies funcionais em comparação com o protocolo de reação padrão em duas fases. Nós descrevemos o uso de então-acrescida de lamelas com células de fluxo PDMS multi-canal que permitem conexões de tubulação robusto ser feita sem cola. Estas células de fluxo mais incluem vários controlado por computador entradas para cada câmara de fluxo que permitem o fluxo de reagente automatizado para reduzir o tempo de prático durante a instalação e ensaio maior throughput.

Protocol

1. preparação da biotina-λ-DNA Nota: moléculas de DNA-biotina-λ são preparadas por ligando um biotina-etiquetadas do oligonucleotide, 5 '-AGGTCGCCGCCC(A) 20 – biotina – 3 ' para Λ-DNA moléculas 20. Biotina 0,1 mM de preparar rotulado oligo em tampão TE. Estoque de λ-DNA de 0,5 mg/mL de calor a 65 ° C por 60 s e mergulho no gelo molhado logo. Nota: Retardamento de rápido resfriamento reduz λ-DNA concatemerization. Pipetar 100 µ l da solução de λ-DNA em um tubo de microcentrifugadora. Adicionar 1 µ l do oligo 0,1 mM em 9 µ l de tampão TE. Adicionar 2 µ l da solução de oligo ao microcentrifuga tubo contendo o DNA de λ. Homogeneiza. Nota: Oligo está presente em aproximadamente um 12-fold excesso molar durante o fim de λ-DNA complementar. Aquecer a mistura de λ-DNA/oligo a 65 ° C por 60 s. Esfriar lentamente a mistura à temperatura ambiente. Nota: Este passo permite que o oligo recozer a extremidade λ-DNA complementar. Coloque a mistura sobre o gelo. Adicionar 11 µ l de tampão de reação T4 DNA ligase (concentração de buffer final 1 x). Misture suavemente. Em seguida, adicione 2 µ l (800 unidades) da enzima de T4 DNA ligase. Misture suavemente. Incubar a mistura durante 2 h a 16 ° C, ou durante a noite a 4 ° C. Purificar o produto utilizando tubos de filtro centrífugo com um limite de peso molecular nominal de 100 kDa. Especificamente, transfira a mistura do passo 1.9 em um tubo de filtro centrífugo e centrifugação a 14.000 x g por 5 min, lavar duas vezes com tampão de TE 400 µ l e recolher o produto purificado. Nota: Os como-purificado biotina-λ-DNAs em tampão TE são estáveis a-20 ° C por até um ano. 2. Lamela functionalization Nota: as lamelas de vidro são acrescidas por reagir com silano-PEG-biotina. Este protocolo de reação de uma etapa é mais simples e mais confiável em nossa experiência que a reação de duas etapas padrão protocolo 20. Lamela functionalization com silano-PEG-biotina cria locais obrigatórios para streptavidin e minimiza o DNA inespecífico e adsorção de proteínas à superfície lamela. Sonicate cinco lamelas de n º 1 em etanol a 95% no interior de uma coloração jar por 10 min e depois enxaguar com água ultrapura por três vezes. Nota: A quinta lamela fornece um sobressalente em caso de ruptura. Encher o frasco de coloração com 1m KOH, proceda à sonicação durante 10 min e depois enxaguar com água ultrapura três vezes. Repetir duas vezes o ciclo de 2.1-2.2. Secar as lamelas sob fluxo de gás limpo e seco N 2. Além disso, limpe e seque as lamelas aplicando tratamento de plasma de ar à pressão de 900 mTorr 5 min. Incubar as lamelas com 25 mg/mL silano-peg-biotina dissolvido em etanol a 95% em temperatura ambiente por 2 h. especificamente, solução de silano-peg-biotina 50 µ l entre duas lamelas limpa e secas de sanduíche e incubar a lamela " sanduíches " dentro de uma caixa de ponta de pipeta fechado com cerca de 10 mL de água na parte inferior (não em contato com as lamelas) para minimizar a evaporação do solvente. Lavar em excesso PEG moléculas com água ultrapura e seco o PEG revestido lamelas sob limpo seco fluxo de gás de 2 N. Nota: As lamelas funcionalizadas podem ser armazenadas três dias em condições ambientes. 3. Construção da célula de fluxo Nota: células de fluxo são construídas pela imprensa uma fita dupla-adesivo com canais pre-cut entre um PEG acrescida da lamela e uma laje PDMS contendo orifícios de entrada e saída. Vários canais estão integrados por célula de fluxo. Projetar canais de fluxo em um software de CAD e cortar os canais (a largura, profundidade e comprimento de cada canais são 1, 0,13 e 12 mm, respectivamente) em uma fita adesiva dupla usando um cortador de fita (normalmente oito canais estão integrado por célula de fluxo). Remover resíduos de fita para formar os canais de fluxo. Tornar-se lajes PDMS, misture 45 g de PDMS com 5 g de reagente de reticulação (o suficiente para fazer doze 5 mm espessura SPDM lajes que podem ser armazenadas indefinidamente sob condições ambientais) usando uma batedeira, despeje a mistura em dois pratos de Petri de 10 cm e deixa o pratos para dentro de uma câmara de vácuo até essencialmente todas bolhas de ar sumiram foram (manualmente remover bolhas de ar se qualquer permanecem quando os pratos são removidos da câmara de vácuo). Depois transferir os pratos em um forno de 80 ° C até PDMS solidifica (cerca de 2h). Cortar uma laje de PDMS que corresponde ao tamanho da fita adesiva dupla com canais pre-cut. Casca de proteção um filme fora a fita adesiva de dupla e aderir o filme com uma face plana da laje PDMS. Os buracos e saídas de ar sobre a laje PDMS usando um furador de biopsia com uma agulha de calibre 23. Descasque o segundo filme de proteção fora a fita adesiva de dupla e aderir o assembly de PDMS-fita para a superfície funcionalizado da lamela (certifique-se que a lamela é plana. Veja uma foto de uma célula de fluxo totalmente montados na Figura 1a). 4. TIRF Imaging Nota: biotina-λ-DNAs estão amarrados a uma superfície de canal de fluxo e fluxo laminar é aplicado ao fluxo de esticar as moléculas de DNA ( Figura 1b). O > 80% esticada servir de moléculas de DNA como modelos espacialmente estendidos para observar a atividade de ligação e transporte de moléculas fluorescente etiquetadas. As trajetórias de moléculas simples são controladas por lapso de tempo de imagem TIRF ( Figura 1 c & e). Correção da célula de fluxo em um microscópio estágio e carga pre-libertos em branco buffer (fosfato de sódio de 10 mM, 2 mM de NaCl, 50 µM EDTA, etanol de 20 mM, 5% (v/v) glicerol, 0,01% Tween-20, 1% (v/v) β-Mercaptoetanol, pH 7,4), 0,2 mg/mL de solução de estreptavidina, 1 mg / mL de solução de albumina de soro bovino (BSA) e solução de DNA-biotina-λ 100 pM em quatro reservatórios que cada um tem uma tubulação de Tygon conectado a um valor de solenoide e outra tubulação de Tygon ligado ao tubo ESPIADA por sleeving da tubulação de Tygon sobre o menor (de tubos PEEK impede o refluxo dos reagentes). Desgaseificar pequenos volumes de buffer por exposição durante a noite a vácuo ou menor exposição ao vácuo com agitação (até que as bolhas não são mais visíveis). Inserir o tubo PEEK do reservatório tampão em branco no furo de uma entrada da célula de fluxo. Encha o canal, fluindo no buffer em branco e insira três outros tubos PEEK nos orifícios de entrada a pressão do ar impulsionado o fluxo de cada reagente é controlada por válvulas de solenoide e totalmente automatizada através de um script de computador. Tenha cuidado para não induzir a formação de bolhas de ar no canal. Conectar uma tubulação de Tygon com um curto tubo PEEK do orifício da tomada para um contentor de resíduos. A tubagem de PEEK curta na saída ajuda a suprimir a formação de bolhas de ar durante a infusão, mantendo a pressão positiva dentro do canal. Tethering biotina-λ-DNA moléculas a uma superfície de canal de fluxo. Fluxo de 0,2 mg/mL solução de estreptavidina, incubar durante 5 min e então fluir no buffer em branco para lavar o streptavidin desacoplado. Fluxo em solução de 1 mg/mL BSA, incubar por 1 min e então fluir no buffer em branco para lavar a BSA desacoplada. Nota: Suprime a BSA mais DNA e adsorção de amostra para a superfície. Fluxo em solução de DNA-biotina-λ 100 pM, incubar durante 10 minutos e então fluir no buffer em branco para lavar os DNAs desacoplados. Nota: Depois que o DNA está vinculado à superfície, evitar fluxos rápidos para evitar danificar as moléculas de DNA amarradas. Para verificar a qualidade da lamela funcionalizada, fluxo no DNA coloração tintura como Sytox laranja nas condições de ensaio a ser usado (Leia abaixo 4.6) e começar a fluorescência de imagem iluminação de laser em 532 nm. Nota: A qualidade da lamela funcionalizada é geralmente boa e a densidade das moléculas de DNA de fluxo esticada será alta. É essencial ter bastante elevada densidade de moléculas de DNA de fluxo esticada para que a ligação de DNA e eventos de difusão de deslizamento/1D podem ser observados. Fine tune o ângulo TIRF para conseguir o melhor sinal à relação de ruído de imagens de moléculas de DNA esticadas ( Figura 1D). Para gravar as trajetórias de moléculas simples se movendo ao longo do DNA, repita os passos 4.2-4.4 dentro de um novo canal (sem DNA coloração tintura) e, em seguida, infundir previamente desgaseificado sub-nanomolar fluoróforo rotulado de moléculas em uma taxa de fluxo elevada suficiente usando uma bomba de seringa e recolher imagens de fluorescência de lapso de tempo, com uma taxa de quadros de 100 Hz. Nota: Uma taxa de fluxo equivalente a um número de Weissenberg (Wi: o produto adimensional de muito tempo polímero relaxamento – aproximadamente 0.2 s λ-DNA – e a taxa de cisalhamento – a mudança na velocidade de fluxo com a distância da superfície da lamela) de 500 dentro do canal é recomendado para a imagem latente de molécula com uma taxa de quadros de 100 Hz 21. Recolher 10.000 frames em um campo de visão (FOV) para produzir um filme e coletar filmes semelhantes de vários FOVs (normalmente 10), por exemplo. Nota: A densidade de partículas única em um FOV deve ser nem muito alto – que irá complicar a análise de dados, tornando a atribuição do objeto através de quadros ambíguas, nem muito baixos – susceptíveis de conduzir à baixa ocorrência de eventos única molécula de DNA. Otimizar a intensidade de iluminação para que as moléculas vinculadas à superfície lamela são rapidamente foto-branqueada para suprimir o fundo enquanto moléculas difusão no DNA não são clareadas também rapidamente para que podem ser detectadas trajetórias mais. Nota: Normalmente usamos densidade de potência 200-800 W/cm 2 o FOV. No final da etapa 4.6, infundir coloração tintura de DNA para confirmar que as moléculas de DNA ainda podem ser alongada fluxo. Executar ambas as amostras de controlo positivo e negativo. Nota: Um bom controle positivo é um tetrapeptide, diversos (TMR)-KRRR (TMR é acoplado à amina N-terminal) que tem uma média constante de difusão 1D de 10,5 ± 0,7 (erro padrão) M (bp 2/s) em pH neutro 11. Um bom controle negativo é para medir amostras etiquetadas de interesse no buffer de ensaio em um canal que não tem nenhum DNA amarrado, onde deve ser detectada nenhuma atividade de difusão no ADN. 5. Análise de dados: Nota: uma única partícula personalizada, software de rastreamento é usada para identificar as trajetórias de moléculas simples difusão ao longo do DNA e estimar constantes de difusão. Este software primeiro determina as posições de centroide de partículas única com exatidão elevada, identifica partículas presas na superfície de lamela e vincula as partículas em quadros diferentes para formar as trajetórias de lapso de tempo. Dessas trajetórias, estimam-se as constantes de difusão 1D. Para iniciar a análise de dados, um script software aberto (ver tabela de materiais) e vá para o diretório de uma única partícula software de rastreamento. Abra o script chamado " largedataprocess3.m ". Um parâmetro importante a ser definido é o valor de limiar para a deteção de partícula única. Para determinar o valor de limiar ideal, execute o " Determine_threshold_value.m " script. Este script irá indicar como o valor de limiar afeta a deteção de partícula única. Depois de determinar o valor de limiar ideal, execute o " largedataprocess3.m " script Após a conclusão de uma única partícula acompanhamento análise, filtrar as trajetórias crus executando o " Trajectory_filtering.m " script. Uma Interface de usuário gráfica (GUI) é construído em Visualizar o passo filtragem. Painel de sobre o GUI, definir o deslocamento mínimo ao longo do DNA, MinXDisp, para 2 pixels; definir o máximo deslocamento transversal ao ADN, MaxYDisp, para 2 pixels; definir o número mínimo de quadros, minFrames, a 10; definir o número mínimo de Estados de triplet, minTriplets, 10; definir a constante de difusão mínima ao longo do DNA, D_par, para 0; definir a constante de difusão estimada máxima transversal ao ADN, D_trans, para 10m (bp 2) S -1; Defina o parâmetro mínimo estatística, Chi 2 stat, para -5; definir o rácio mínimo de deslocamento ao longo do DNA para aquela transversal ao DNA, MinX/Y, 2. Nota: Todas as trajetórias crus que passam estes parâmetros de filtragem estão listadas na tabela 1, e aqueles que não estão listados na tabela 3. Clique em uma trajetória número na tabela 1, a trajetória será deslocada em gráficos 1 & 2. Clique sobre o " Play " botão para reproduzir as imagens de fluorescência cru. Clique sobre o " Add_to_Table2 " para identificar a trajetória como uma única molécula deslizando a trajetória. No final, todas as trajetórias adicionadas ao Table2 serão salvo quando fechar o GUI. Para calcular as constantes de difusão média, execute o script " Calculate_mean_diffusion_constant.m ". Estima-se a constante de difusão média do conjunto de trajetórias que tenho passado todas as etapas de filtragem e foram adicionados à tabela 2.

Representative Results

Figura 2a mostra as trajetórias detectadas de pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B é conjugada com o resíduo de cisteína) moléculas de difusão no DNA em 2 mM NaCl de buffer no pH 6,5. A difusão de pVIc é bi-direcional e impulsionado pela energia térmica do ambiente. Dessas trajetórias, as constantes de difusão 1D (valores de D1) são estimadas para cada trajetória (ver o histograma na Figura 2b). O valor de D1 deste pVIc conjugado médio é calculado para ser 22,2 ± 0,9 (erro padrão) M (bp2/s) calculando a cada valor de D1 em trajetórias ponderadas pelo número de chamadas de posição consecutiva triplet contidos em cada trajetória. Figura 1 : Aparelho para controlar o movimento de moléculas simples ao longo do DNA.a) um PDMS de oito canais microfluídicos microplaqueta adere a uma lamela funcionalizada à qual DNA pode ser amarrado (com moeda de quarto de EUA para escala); b) fluxo esquemático de célula zoom mostrando moléculas alongada fluxo λ-DNA; c) diagrama esquemático do sistema de microscópio e fluxo TIRF para alongamento do DNA; d) imagem TIRF de um fluxo alongada λ-DNA; e) imagem TIRF de pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B é conjugada com o resíduo de cisteína) moléculas acoplado a um fluxo alongada λ-DNA. Esta figura foi modificada com a permissão de2,12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2 : Difusão unidimensional de pVIc (GVQSLKRRRCF) ao longo do DNA.a). difusão de pVIc ao longo do fluxo esticada λ-DNAs (137 trajetórias) no buffer de 2 mM NaCl a pH 6,5. x(t) e y (t) são os deslocamentos ao longo e transversal para λ-DNA, respectivamente. Linhas horizontais pontilhadas indicam pontos faltando resultantes de tintura piscando. b). histograma da constante de difusão, D1 para pVIc difusão ao longo de λ-DNAs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Quando se muda de protocolo em duas etapas tradicionais lamela functionalization reação a um protocolo de reação de uma etapa, notamos que a confiabilidade da lamela functionalization é significativamente melhorada. Como o tempo total de hands-on para a preparação da lamela é menos de 30 min, recomendamos preparar lamelas frescas cada imagem única molécula do dia é planejado. Para minimizar a deterioração de silano-PEG-biotina, o reagente deve ser aliquotadas e armazenado sob gás seco de2 N a-20 ° C, após o recebimento. Aqui não usamos PEG moléculas que produzem -COO– ou -CH3 grupos terminais que foram usados no passado20. As cargas negativas dos grupos -COO– e os grupos de3 -CH hidrofóbicas foram utilizadas para evitar a adsorção não específica de moléculas de DNA e proteína específica amostras para a superfície, respectivamente. Observamos muito baixa adsorção de superfície por amostras de peptídeos pequenos na superfície PEG totalmente terminada com biotina, enquanto silano-PEG-COOH e/ou silano-PEG-CH3 pode ser útil para os ensaios de certas amostras de proteína ou ensaio em condições (tais como pH < 7.5) promova interações DNA-superfície.

A mudança de células de fluxo de slide de vidro para fluxo PDMS células acelera a construção de célula de fluxo e permite a fácil integração de múltiplos canais. Nós muitas vezes engenheiro oito canais por célula de fluxo para habilitar oito experimentos independentes por lamela funcionalizado. Para aumentar ainda mais a taxa de transferência por lamela, poderia ser usado ainda maior número de canais de microfabricadas.

É aconselhável para evitar a formação de bolhas de ar dentro do canal a qualquer momento após o enchimento inicial. Geralmente, as bolhas de ar não causa perda de DNAs amarrados (embora isso seja possível), mas prefiro dificultarem o fluxo e possivelmente causar DNAs se ater a lamela. Tampão de desgaseificação e a adição de quantidades pequenas de surfactante são normalmente eficazes na prevenção da formação de bolhas dentro do tubo e o fluxo de canal. Em casos onde as bolhas de ar são introduzidas para o tubo, tente eliminar as bolhas sob um fluxo lento e certifique-se de que eles não flui através da região onde o DNAs são amarrados.

Um software de análise de dados simplificada e eficiente é fundamental, devido à enorme quantidade de dados gerados. Normalmente coletamos 700.000 imagens de alta resolução de medições na pilha de um fluxo, que pode ser processada usando nossa única partícula personalizada, software de rastreamento dentro de um dia em um computador desktop com um quad-core processador e 32 Gb de memória. A taxa de falsos positivos de detecção de trajetórias de difusão 1D pelo software (passo 5.5) é dependente de amostra e pode ser bastante baixa tendo em conta que: 1) a densidade de partículas única no FOV é baixa o suficiente para que haja ambiguidade pouco ligando as partículas através de quadros ( amostras da proteína, em geral, são mais propensas a adsorção não específica para a lamela do que amostras de peptídeo, e assim, o buffer e a densidade de potência para cada proteína precisa ser otimizado da amostra); 2) o sinal à relação de ruído de partículas única é alto o suficiente para que a probabilidade de falso-identificação de partículas é baixa. Ainda assim, o software pode cometer erros ocasionais, e recomendamos a inspeção manual dos dados usando o fornecido GUI para avaliar o desempenho do software. Em um aplicativo é particularmente sensível à detecção de trajetória de falso-positivos, parâmetros de processo, incluindo o valor de limiar, minFrames, minTriplets e Chi2stat podem ser definidos de forma mais rigorosa à custa de menor sensibilidade para vinculação de verdade eventos e potencialmente maior viés estatístico na identificação da trajetória. Aqui partilhamos e descrever nossa única partícula que segue o software com a esperança de ajudar a padronizar os métodos de análise de dados e estimular a discussão sobre as práticas recomendadas.

Em nosso protocolo, que requer fluxo contínuo durante a imagem para manter o estado esticado das moléculas de DNA de modelo, o fluxo de fluido poderia influenciar o transporte de algumas proteínas ao longo de modelos de DNA se eles difundem através de um mecanismo de salto ou se a hidrodinâmica raio do fluoróforo etiquetado é grande22,23. Enquanto tal preconceito pode ser medido e corrigido na maioria dos conjuntos de dados, o transporte de proteínas rotulado com um fluoróforo pequeno e difusão por um mecanismo de deslizamento não é tipicamente tendencioso em medida detectável pelo fluxo2,4, 24. Notavelmente, o impacto da velocidade de fluxo no transporte de proteínas ao longo do DNA tem sido usado para estudar os mecanismos de difusão ao longo do DNA23de proteína. A estreitamente relacionados a abordagem alternativa, que permite medições na ausência de fluxo utiliza modelos de DNA com biotina em ambos termini que transitoriamente são esticados em fluxo e amarrados pelas duas extremidades para a lamela tal que as moléculas de DNA permanecem em um configuração estendida quando o fluxo é desligado25,26,,27,28. A abordagem de duplo-baraço tem a vantagem de permitir que os experimentos de fluxo livre transporte mas requer modificação de ambas as extremidades das moléculas de DNA do modelo, controle de fluxo de cuidado durante o tethering e caracterizando as distâncias entre os dois locais amarrados. Além disso, deve ser avaliado o impacto das tensões heterogêneas e dinâmica conformacional de DNA através de moléculas de DNA no ensaio de single-molécula.

No total, além de estudar a difusão 1D de moléculas ao longo do DNA, o ensaio relatada como única molécula pode beneficiar muitas em vitro bioquímicos e biofísicos estudos a nível de molécula incluindo DNA alvo de processos de busca por proteínas, actividades enzimáticas no DNA e muito mais.

Solução de problemas

Problema 1: Os canais de fluxo de vazamento.

Solução: em primeiro lugar, certifique-se de que o design dos canais de fluxo permite que a margem de pelo menos 1,5 mm para vedação em torno e entre canais; e então, durante a montagem da célula de fluxo, certifique-se que as superfícies de contato entre a lamela, a fita adesiva de dupla e a laje PDMS são plana, seca e livre de detritos, que a pressão aplicada para formar o selo é uniforme, e que a operação de vedação é realizada em temperatura ambiente.

Problema 2: A densidade de DNAs amarrados é muito baixa.

Solução: Este problema surge quando a PEG functionalization eficiência é baixa ou as moléculas de DNA não são acrescidas com biotina. De nossa experiência, a densidade do DNA amarrado deve ser elevada para > 90% das lamelas preparado de fresco ou armazenados adequadamente silano-PEG-biotina reagente. Em casos quando a densidade do DNA amarrado é baixa com um lote comprovado de biotina-λ-DNA, tente aumentar as concentrações de silano-PEG-biotina durante functionalization PEG e concentrações de streptavidin e biotina-λ-DNA durante DNA amarrar. Se isto falhar, substitua os reagentes PEG e estreptavidina.

Problema 3: DNAs furar a lamela umd não pode ser esticado por fluxo.

Solução: Este problema também pode surgir quando a eficiência de functionalization PEG é baixa e é agravada pela pH baixo do ensaio. Tente fluindo em BSA mais ou elevar o pH (por exemplo, a 8.0) para ajudar a suprimir a adsorção de DNA à superfície (passo 4.3.2). Se a adsorção do DNA é um problema persistente sob uma condição de ensaio específico, tente incluindo acima de 90% silano-PEG-COOH durante functionalization PEG.

Notas de análise de dados:

Nós usamos personalizada única partícula software de rastreamento para identificar trajetórias de moléculas simples difusão ao longo do DNA, de que suas constantes de difusão 1D, D1 são estimados. Para melhorar a análise de dados, implementamos o algoritmo simetria radial18 para localização de partículas e o estimador baseado em covariância19 para estimar constantes de difusão 1D, que aceleraram dramaticamente a análise dos dados sem comprometer a precisão. Nós validado anteriormente o software personalizado, analisando dados simulados11. As principais etapas são descritas abaixo.

Identificação de partículas:

Esta etapa é para a detecção e segmentação de partículas – manchas de difração limitada – de fundo. Primeiro, espacialmente passa-banda filtrar as imagens para aumentar o sinal de partículas no 3-5 escala de pixel (que corresponde ao tamanho da função de ponto-propagação em nosso sistema) e depois com base na intensidade de limiar (ver roteiro: spt2_SD_sandbox.m).

Atribuição de centroide

Segmentar a imagem apenas localiza as moléculas a nível de pixel de resolução espacial. Para localizar moléculas de precisão muito maior, empregam a simetria Radial do algoritmo de resolução super18 imagens filtradas como acima. (Este método é baseado em um cálculo analítico e assim vastamente reduz a carga computacional em comparação com outros métodos populares de alta precisão como encaixe Gaussian 2D (ver roteiro: spt2_SD_sandbox.m).)

Partícula de rastreamento:

Para acompanhar a trajetória de uma partícula através do tempo, devemos re-identificar as mesmas partículas que se movem entre os quadros. Consideramos os estágios de iniciação, piscando e rescisão ser componentes de uma trajetória. Podemos restringir o enlace de partículas na atuais quadros que figuram nos quadros anteriores pelo deslocamento máximo permitido por quadro. Em casos onde as ligações múltiplas são possíveis, o algoritmo de Jonker-Volgenant é usado para produzir conjuntos de enlace globalmente ideal (ver roteiro: traceTraj4_kx.3.m).

Estimativa de D1:

Para estimar os valores de D1 de trajetórias, usamos o estimador baseado em covariância (CVE)19. Baseado em um cálculo analítico, este método é mais computacionalmente eficiente e estatisticamente rigorosos do que outros métodos tais como regressão dos deslocamentos quadrados médios comumente utilizados (ver roteiro: runspt5_SD.m).

Trajetória de filtragem:

Algumas trajetórias contenham artefatos como ligação de moléculas de superfície-limite e devem ser removidas. Implementamos diversas características tais como mínimo deslocamento paralelo ao DNA, máximo deslocamento transversal ao DNA, comprimento mínimo de trajetória, o número mínimo de posições triplet consecutivos detectado e pontuação de probabilidade mínima (ver Xiong et al11 para definição) que podem ser filtrados para isolar um conjunto minimamente tendencioso de trajetórias susceptíveis de representar moléculas difusão no ADN (ver roteiro: sptViewFig2_update3x.m).

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Tony Kulesa, Robin Kirkpatrick e Evangelos Gatzogiannis para obter ajuda com a configuração inicial de instrumentação e testes. Agradecemos ainda mais Tony Kulesa para ajuda significativa escrita e avaliando a única partícula personalizada, software de rastreamento. Este trabalho foi financiado por fundos de inicialização e um prémio de carreira na Interface científica (para PCB) da Fundação Wellcome Burroughs.

Materials

Biotin labeled oligo, 5’-AGGTCGCCGCCC(A)20-biotin-3’ IDT Custom oligo synthesis Standard desalting purification is sufficient
λ-DNA New England Biolabs Inc. N3011S Make aliquots and minimize freeze-thaw cycle number
T4 DNA ligase and ligation reaction buffer New England Biolabs Inc. M0202S
Amicon centrifugal filter tubes with NMWL of 100k Dalton EMD Millipore UFC510008
No. 1 glass coverslips VWR 48393-106
Pure ethanol VWR 89125-186
Potassium hydroxide pellets Fisher Scientific P250-500
Plasma cleaner, model No. PDC-32G Harrick Plasma
Silane-peg-biotin Nanocs PG2-BNSL-5k Store at -20oC in dry nitrogen gas
A CAD software Autodesk AutoCAD
Double-adhesive tape Adhesive Applications 8512-2-DP/DL
Tape cutter, model No. CE5000-40-CRP Graphtec America
PDMS and crosslink reagent kit R.S. Hughes RTV615 CLEAR 010
Degassing chamber, model No. F42010-0000 BEL-ART Products
Mixer, model No. ARV-310 Thinky
Hole puncher, Harris Uni-Cores, Size 0.5 mm Harris Uni-Cores This can be substituted with a manual biopsy punch with a similar needle size
Tygon tubing Cole Parmer EW-06420-02 0.020" ID, 0.060"OD
Peek tubing Western Analytical PK007-031-Y 0.007" ID, 0.031"OD
Streptavidin New England Biolabs Inc. N7021S
Bovine serum albumin (BSA) New England Biolabs Inc. B9000S
Sytox orange nucleic acid stain Invitrogen S11368
Ti-E Microscope Nikon Microscope, camera, objective, dichroic mirror and bandpass filter can be substituted for similar equipment
100x Objective, NA/1.49, CFI Apo TIRF Nikon
CMOS camera Hammamatsu Orca Flash 4.0
Dichroic mirror Semrock FF560/659-Di01-25×36
Bandpass filter Semrock FF560/659-Di01-25×36
532 nm laser Rayscience Innovation Limited, Shanghai OEMLL-FN-532nm-C Select wavelength to correspond to stain of choice
Syringe pump Chemxy Fusion 200
TMR-KRRR, >=85% purity MIT Biopolymer lab
pVIc-Cy3B, HPLC purified A gift from Dr. Walter Mangel at Brookhaven National lab
Script programming software MathWorks Matlab
* see parts list for solenoid valves, computer interface, and assembly instructions at: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers
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References

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Single MoleculeFlow Stretching AssayDNA TransportBiotin-labeled Lambda-DNAPEG Functionalized CoverslipsHigh Throughput Flow CellTIRF ImagingSingle Particle Tracking

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Xiong, K., Blainey, P. C. A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA. J. Vis. Exp. (128), e55923, doi:10.3791/55923 (2017).
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