シンプルで堅牢、かつ高スループットの単一分子 DNA 分子の輸送を研究するためのストレッチ法の実装を流れ

1 ビオチン λ DNA の準備 注: ビオチン λ DNA の分子はビオチン標識オリゴヌクレオチド、5 を縛ることにより作製した '-AGGTCGCCGCCC(A) 20 – ビオチン – 3 ' に。Λ DNA 分子 20。 準備 0.1 mM ビオチン標識オリゴ TE バッファーで。 60 65 ° C で熱 0.5 mg/mL λ DNA 株式 s およびすぐに濡れた氷に突入 。 注: 高速急冷 λ DNA concatemerization を低減します。 微量遠心チューブに λ DNA の解決のピペット 100 μ L. TE バッファーの 9 μ L に 0.1 mM oligo の追加 1 μ L. Λ DNA を含む遠心チューブにオリゴ ソリューションの追加 2 μ L。ミックス徹底的 。 注: オリゴが相補的な λ DNA の端に約 12-fold モル過剰に存在します。 60 65 ° C で λ DNA/オリゴの混合物を熱 s. はゆっくりと部屋の温度に混合物を冷却します 。 注: この手順により、相補的な λ DNA の端にアニールするオリゴ。 は、氷の上の混合物を配置します。T4 DNA リガーゼ反応バッファーの 11 μ L を追加 (最後のバッファー濃度 1 x)。優しく混ぜます。T4 DNA リガーゼの酵素の 2 μ L (800 台) を追加します。優しく混ぜる。 2 h、16 ° C または一晩 4 の混合物をインキュベート ° C は、遠心フィルター チューブを用いた 100 kDa の分子の公称重量制限製品を浄化します。具体的には、遠心フィルター チューブおよび 14,000 x g で 5 分間遠心にステップ 1.9 混合物を転送、400 μ L TE バッファーで 2 回洗浄、精製された製品を収集します 。 注: として精製ビオチン-λ-Dna TE バッファーで、1 年間、-20 ° C で安定した。 2。Coverslip 機能化 注: ガラス coverslips はシラン-ペグ-ビオチンとの反応による官能基化します。このワンステップ反応プロトコルは、単純な標準の 2 段階反応プロトコル 20 我々 の経験でより信頼性の高いです。Coverslip 機能化シラン-ペグ-ビオチンとストレプトアビジン結合部位を作成し、非特異的な DNA と coverslip 表面へのタンパク質の吸着を最小限に抑えます。 Sonicate 5 号 1 coverslips 汚損の内 95% エタノールに 10 分間 jar し、3 回純水で洗い流しします 。 注: 5 番目の coverslip 破損の場合スペアを提供します。 1 M コで染色の瓶を埋める、10 分間超音波し、3 回純水で洗い流しします。 2.1 2.2 サイクルを 2 回繰り返します。 乾燥きれいな乾いた N 2 ガス流 coverslips。 さらにきれいにし 5 分間 900 mTorr 圧空気プラズマ処理を適用することによって coverslips を乾燥 25 mg/mL シラン-ペグ-ビオチン具体的には 2 のため室温で 95% エタノールに溶解と coverslips を孵化、2 つのきれいな乾いた coverslips 間 50 μ L シラン-ペグ-ビオチン ソリューションをサンドイッチ、インキュベート、coverslip " サンドイッチ "(coverslips) 接触していない下部に水の約 10 mL の閉じたピペット チップ ボックスの内側溶媒蒸発を最小限にします。 洗い流す純水とペグ コーティング下 coverslips きれいなドライ余分な PEG 分子乾燥 N 2 ガス流れ 。 注: 官能 coverslips に格納できる周囲条件下で 3 日間にします。 3。細胞構築の流れ 注: フローセル、カット済みのチャンネル間でダブル粘着テープを挟むによって構築され、PEG 修飾 coverslip と入口と出口の穴を含む PDMS スラブ。フローセルあたり複数のチャネルを統合します。 CAD ソフトウェアで流路を設計し、ダブル粘着テープのテープ カッターを使用して (幅、深さおよび各チャネルの長さが 12 mm、0.13 1 それぞれ) チャンネルをカット (通常 8 つのチャンネルをフローセルあたり統合します)。テープ残差流路を形成するを削除します。 PDMS スラブにする は徹底的に PDMS (12 5 mm 厚 PMDS スラブ周囲条件下で無期限に格納できるを作る十分な) 架橋結合の試薬の 5 g と 45 g を混ぜるミキサーを使用して、2 つの 10 cm のシャーレに混合物を注ぐし、を残して、本質的にすべての気泡まで真空チャンバ内の料理がなくなっている (手動で空気の泡を削除する真空チャンバーから削除されると、料理が残っている場合)。PDMS 凝固 (約 2 h) まで 80 ° C のオーブンに料理を転送します。 は、カット済みのチャンネルを持つダブル粘着テープのサイズに一致する PDMS スラブをカットしました。皮 1 つ保護フィルム両面テープをオフし、PDMS スラブの平らな面にフィルムを付着します。23 g 針生検の穴パンチャーを使用して PDMS スラブの出口と入口の穴をパンチします。 ダブル粘着テープを 2 番目の保護フィルムをはがし、付着、coverslip の機能面に PDMS テープ アセンブリ (、coverslip がフラットであることを確認してください。 図 1 a に完全に組み立てられた流体セルの図を参照). 4。全反射イメージング 注: ビオチン λ Dna を流れチャネル表面に繋留し、流を適用して流ストレッチ DNA 分子 ( 図 1 b)。> 80% が蛍光に分類された分子の結合と輸送活性を観察するための空間拡張テンプレートとして DNA 分子サーブを伸縮します。単一分子の軌道を追跡タイムラプス全反射蛍光イメージング法を用いた ( 図 1 c & e). 顕微鏡ステージと負荷前脱空バッファー (10 mM リン酸ナトリウム、2 mM の NaCl、50 μ M EDTA、20 mM のエタノール、グリセリン 5% (v/v)、0.01% Tween 20、1% (v/v) β-メルカプトエタノール、pH 7.4) のフロー ・ セルの修正 0.2 mg/mL のストレプトアビジン溶液、1 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA) ソリューションおよび各ソレノイド値接続タイゴン チューブ、PEEK チューブ上小さい PEEK チューブ (タイゴン チューブをスリーブで接続別のタイゴン チューブ 4 つの貯水池に 100 pM ビオチン λ DNA ソリューション試薬の逆流を防止します)。真空に一晩露出または (泡が表示されなく) まで攪拌真空への短い露出によってバッファーの小さいボリュームをドガします。 は、フロー ・ セルの 1 つの入口の穴に空白バッファー貯水池の PEEK チューブを挿入します。空のバッファーに流れることによってチャネルを首相し、各試薬の流れを駆動空気圧を電磁弁で制御し、を介してコンピューターのスクリプトを完全に自動化の入口の穴に他の 3 つの PEEK チューブを挿入します。チャネルの空気泡の形成を誘導するように注意してください。 は、廃棄物コンテナーにコンセントの穴から短い PEEK チューブ タイゴン チューブを接続します。コンセントで短い PEEK チューブによりチャネル内の肯定的な圧力を維持することによって液注入時に気泡の空気を抑制します。 フロー チャネル表面にビオチン λ DNA 分子をテザリングします。 フロー 0.2 mg/mL ストレプトアビジン溶液で 5 分間インキュベートし、非連結ストレプトアビジンを洗浄する空のバッファーで、フローします。 フロー 1 Mg/ml BSA 解決で 1 分間インキュベートし、非連結の BSA を洗浄する空のバッファーで、フローします 。 注: さらに BSA を抑制する DNA サンプル表面への吸着と。 フロー 100 pM ビオチン λ DNA ソリューションで 10 分間インキュベートし、非連結の Dna を洗浄するための空のバッファーで、フローします 。 注: 表面に DNA をバインドすると、テザーの DNA の分子への損傷を防ぐために速い流れを避ける。 官能 coverslip の品質をチェックする DNA アッセイ条件下でオレンジ Sytox などの色素を染色するため (読み取り 4.6)、流れし、蛍光下で 532 nm レーザー照射を開始します 。 注: 官能 coverslip の品質が良好であり、伸ばして流れ DNA 分子の密度が高くなります。DNA 結合およびスライド/1 D 拡散イベントを検出できるので、伸ばして流れ DNA 分子の十分に高い密度を持つことが不可欠です。 最高の信号対雑音比の伸ばされた DNA の分子 ( 図 1 d) の画像を達成するために全反射角度の微調整をします。 単一分子、DNA の方向移動の軌跡を記録する (DNA 染色色素)、なし 4.2 4.4 新しいチャネル内の手順を繰り返し、シリンジ ポンプを使用して十分に高い流量で分子を標識済み脱サブ ナノモル fluorophore を吹き込むと100 Hz のフレーム レートとタイムラプス蛍光画像を収集します 。 注: 流量ワイゼンベルグ数に相当 (Wi: 約 0.2 最長高分子緩和時間 – の無次元の製品 – λ DNA のせん断速度 – coverslip の表面からの距離と流速の変化 s) 500 の中のフレーム レート 100 Hz 21 の 1 分子イメージングにはチャンネルをお勧めします。 収集 10,000 フレーム、映画を制作し、サンプルあたり複数 (通常は 10) FOVs から似たような映画を収集に、1 つの視野 (FOV) で 。 注: 1 つの視野の単一粒子の密度する必要がありますどちらも高すぎる – DNA の単一分子イベントの発生率は低いにつながる可能性がありますあいまいでも低すぎる – フレーム間でオブジェクトを代入することによってデータの分析が複雑になりますが。 が照度を最適化 coverslip 表面にバインドされている分子はすぐに抑制する長時間の軌跡を検出する分子 DNA の拡散が余りにすぐに無漂白、背景に写真漂白します 。 注: 我々 は通常、FOV で 200-800 W/cm 2 の出力密度を使用しています。 4.6 のステップの最後に、DNA は DNA 分子が流ストレッチをすることができますまだ確認する色素を染色を吹き込む。 は、両方の正と負のコントロールのサンプルを実行します 。 注: 良い肯定的な制御は、tetrapeptide、TetraMethylRhodamine (TMR)-KRRR (TMR は N ターミナル アミンと結合) 10.5 ± 0.7 (標準エラー出力) M 平均 1 次元拡散定数を持っている (bp 2/s) 中性 pH 11 時。良いネガティブ コントロール アッセイバッファー テザー、DNA に普及活動を検出するない DNA を持たないチャネルの興味のラベル付きのサンプルを測定することです。 5。データ分析: 注: カスタム単一粒子追跡ソフトウェアは DNA に沿って拡散する分子の軌道を識別し、拡散定数を推定するために使用します。このソフトウェアは、高い精度で単一粒子の重心位置 coverslip 表面に立ち往生している粒子を識別し、コマ撮りの軌道を形成するための別のフレームでパーティクルとリンクにまず決定します。1 次元拡散定数の推定これらの軌跡から。 スクリプト ソフトウェアを開き、データの分析を開始 (材料の表を参照)、単一粒子追跡ソフトウェアのディレクトリに移動します。という名前のスクリプトを開いて " largedataprocess3.m "。定義する 1 つの重要なパラメーターは単一の粒子の検出のしきい値値。 最適なしきい値を決定するための を実行、" Determine_threshold_value.m " スクリプト。このスクリプトは、単一粒子の検出に影響を与える値がしきい値を示します。最適なしきい値を決定した後を実行、" largedataprocess3.m " スクリプト 単一粒子の完了後追跡の分析、実行して、生の軌跡をフィルター、" Trajectory_filtering.m " スクリプト。グラフィック ユーザー インターフェイス (GUI) がフィルタ リングの手順を視覚化に組み込まれています。 上の GUI パネル、DNA、MinXDisp、に沿って最小限の変位を 2 ピクセルに設定最大変位を 2 ピクセルに dna、MaxYDisp、横設定フレーム、minFrames の最小数を 10 に設定; minTriplets、三重項状態の最小数を設定10;DNA、D_par、に沿って最小限の拡散定数を 0 に設定します。10 M (bp 2) S -1 に、dna、D_trans、横最大推定拡散定数を設定します。最小限の統計パラメーター集 2 _stat-5; に設定します。2 dna、ミンクス/Y、その横に DNA に沿って変位の最小限の比率を設定します 。 注: これらのパラメーターをフィルター処理を渡すすべての生の軌跡が表 1 に記載されて、かどうかは、表 3 に記載されています。 軌道上の をクリックして番号を表 1 に、グラフィック 1 の軌道が避難されます & 2。クリックして、" プレイ " 生蛍光画像を再生します。クリックして、" Add_to_Table2 " 単一分子軌道をスライドとして軌道を識別します。最終的には、GUI を閉じるとき表 2 に追加されますすべての軌道は保存されます。 平均拡散定数を計算する スクリプトを実行 " Calculate_mean_diffusion_constant.m "。軌道がすべてフィルタ リング手順を渡され、表 2 に追加されたセットから平均拡散係数を推定します。