Una singola molecola semplice, robusta e alta velocità di trasmissione del flusso Stretching Assay implementazione per studiare il trasporto di molecole lungo DNA
Summary
Questo protocollo dimostra un’analisi flusso-stretching di singola molecola semplice, robusta e alta velocità di trasmissione per lo studio della diffusione di (1D) unidimensionale di molecole lungo il DNA.
Abstract
Descriviamo un’analisi flusso-stretching di singola molecola semplice, robusta e alta velocità di trasmissione per lo studio della diffusione di 1D delle molecole lungo il DNA. In questo saggio, lamelle di vetro sono funzionalizzate in una reazione di uno stadio con Silano-PEG-biotina. Le cellule di flusso sono costruite da interposizione di un nastro adesivo con canali pre-tagliati tra un coprioggetto funzionalizzato e una lastra PDMS contenente fori di entrata e di uscita. Canali multipli sono integrati nella cella di un flusso e il flusso di reagenti in ogni canale possa essere completamente automatizzato, che significativamente aumenta la velocità di analisi e riduce il tempo di preparazione manuale per test. All’interno di ogni canale, biotina-λ-DNAs sono immobilizzati sulla superficie e un flusso laminare viene applicato per flusso-tratto delle autorità nazionali designate. Le molecole di DNA sono tese a > 80% della loro lunghezza contorno e servire come spazialmente estesi modelli per studiare l’attività di associazione e trasporto di molecole fluorescente contrassegnati. Le traiettorie di singole molecole vengono rilevate da formazione immagine di fluorescenza di riflessione interna totale (TIRF) time-lapse. Immagini RAW sono analizzate utilizzando snella personalizzata singola particella software di monitoraggio per identificare traiettorie di singole molecole diffondendo lungo DNA e stimare le loro costanti di diffusione 1D automaticamente.
Introduction
Un problema di lunga data nella biologia è proteine come endogene che agiscono a specifici siti nel genoma possono individuare il loro target di DNA abbastanza rapidamente per l’organismo sopravvivere e rispondere efficacemente al suo ambiente. Studi negli ultimi quarant’anni proposto e in gran parte supporto l’ipotesi che la cinetica di DNA target cerca da una proteina può essere accelerato dalla diffusione in cui la proteina si alterna tra diffusione 3D nel bulk e diffusione 1D (tra cui facilitata scorrevole e saltellando processi) lungo il DNA1. È ormai noto che molte proteine coinvolte nella regolazione genica, metabolismo dell’acido nucleico e altri processi sono in grado di scivolare sulla DNA2,3,4,5,6,7 ,8,9. Inoltre, recenti studi ha riferito che anche piccoli peptidi possono associare a e far scorrere il DNA, con la capacità di trasportare un carico; ad esempio, una molecola proteica o PCR primer, lungo DNA10,11,12,13,14.
Negli ultimi 15 anni, l’analisi di flusso-stretching di singola molecola è stato ampiamente utilizzato per studiare l’associazione e la diffusione delle molecole lungo DNA2,15,16. In questo tipo di analisi, molecole di DNA double-stranded biotinilati sono immobilizzati sulla superficie e un flusso laminare viene applicato al flusso allungare il DNA. La > 80% allungato DNAs servire come modelli spazialmente estesi per studiare l’attività di associazione e trasporto di molecole etichettati con fluorofori dove le traiettorie di singole molecole lungo DNA vengono rilevate da formazione immagine di fluorescenza time-lapse. Nella nostra implementazione, ottimizzato per la riproducibilità e facilità d’uso, questo test è costituito da cinque fasi principali: preparazione di biotina-λ-DNA, vetrino coprioggetti funzionalizzazione, costruzione di cella di flusso, fluorescenza e analisi dei dati. In precedenti protocolli17, lamelle di vetro sono state funzionalizzate da primo trietossisilano reagendo con (3-amminopropil) (APTES) e poi con ammina-reattivo polietilenglicole (PEG) reagenti (ad es., NHS-PEG-biotina) per formare uno strato di PEG che resiste l’adsorbimento non specifico di componenti di analisi sulla superficie del vetrino coprioggetti. La qualità dei vetrini coprioggetti funzionalizzati dipendeva in gran parte la qualità dei reagenti di PEG e condizioni di reazione ad ogni passo. Il nostro protocollo descrive un protocollo semplificato funzionalizzazione e costruzione di cella di flusso multiplex che richiede nessun adesivo liquido o tempo di polimerizzazione sulle cellule di flusso del giorno vengono assemblati. Inoltre descriviamo una snella e robusta dati analisi procedura11 che elimina le fasi di regressione computazionalmente intensivi applicando un metodo di simmetria radiale per centroide localizzazione18 e una diffusione basato su covarianza stimatore costante19.
Qui, segnaliamo un semplice, robusto e singola molecola throughput elevato flusso d’allungamento implementazione di analisi con significativi miglioramenti apportati nella funzionalizzazione vetrino coprioggetti, flusso cella costruzione e analisi dei dati. In particolare, abbiamo sviluppato un protocollo di funzionalizzazione coprioggetto One-Step, in cui coprioggetti pulito e asciutti reagiscono direttamente con Silano-PEG-biotina. Questo protocollo semplifica la preparazione del vetrino coprioggetto e migliora l’affidabilità della qualità delle superfici funzionalizzate rispetto al protocollo di reazione standard in due fasi. Descriviamo l’uso di vetrini coprioggetti così funzionalizzati con celle di flusso PDMS multicanale che permettono il collegamento di tubi robusti da effettuarsi senza colla. Ulteriormente queste cellule di flusso sono più insenature computerizzato per ogni camera di flusso che consentono il flusso di reagente automatizzati per ridurre hands-on tempo durante l’installazione e throughput di dosaggio aumentato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quando si passa dal protocollo tradizionale in due fasi coprioggetto funzionalizzazione reazione a un protocollo di reazione di uno stadio, abbiamo notato che l’affidabilità del vetrino coprioggetto funzionalizzazione è migliorato significativamente. Come il tempo totale di hands-on per la preparazione del vetrino coprioggetto è meno di trenta minuti, si consiglia di preparare vetrini coprioggetti freschi imaging di singola molecola ogni giorno è prevista. Per minimizzare il deterioramento di silano-PEG-biotina, il reagente deve essere aliquotati e conservati sotto gas secco di2 N-20 ° c al momento del ricevimento. Qui non usiamo PEG molecole che producono -COO– o -CH3 terminal gruppi che sono stati utilizzati nel passato20. Le cariche negative dei gruppi -COO– e i gruppi di3 -CH idrofobi sono state utilizzate per impedire l’adsorbimento di molecole di DNA e proteine specifici campioni alla superficie, rispettivamente. Osserviamo adsorbimento superficiale molto bassa di campioni di piccolo peptide sulla superficie completamente terminato di biotina PEG, mentre Silano-PEG-COOH e/o Silano-PEG-CH3 potrebbe essere utile per le analisi di alcuni campioni di proteina o quando le condizioni del test (ad esempio pH < 7.5) promuovere interazioni DNA-superficie.
Il passaggio da cellule di flusso scorrevole di vetro al flusso di PDMS cellule accelera la costruzione di cella di flusso e permette una facile integrazione di canali multipli. Progettiamo spesso otto canali per ogni cella di flusso per consentire otto esperimenti indipendenti al vetrino coprioggetti funzionalizzati. Per aumentare ulteriormente la velocità effettiva per vetrino coprioggetti, potrebbe essere utilizzato un numero anche maggiore di canali micro-fabbricato.
Si consiglia di evitare la formazione di bolle di aria all’interno del canale in qualsiasi momento dopo il riempimento iniziale. Solitamente, le bolle d’aria non causano perdita di DNAs tethered (anche se questo è possibile), ma piuttosto interrompere il flusso e possibilmente causare DNAs a bastone per il vetrino coprioggetti. Buffer di degasaggio e l’aggiunta di tensioattivo piccole quantità sono in genere efficace nel prevenire la formazione di bolle all’interno del canale di flusso e tubi. In casi dove le bolle d’aria vengono introdotti ai tubi, provano a scovare le bolle sotto un flusso lento e assicurarsi che essi non passano attraverso la regione dove DNAs sono legati.
Un software di analisi dati snella ed efficiente è fondamentale, a causa della quantità enorme di dati generati. Solitamente raccogliamo 700.000 immagini ad alta risoluzione da misurazioni su cella di un flusso, che possa essere elaborato utilizzando la nostra singola particella personalizzata software di monitoraggio all’interno di un giorno su un computer desktop con un quad core processore e 32 Gb di memoria. Il tasso di falsi positivi di rilevazione traiettorie diffusione 1D dal software (punto 5.5) è dipendente dal campione e può essere molto basso, dato che: 1) la densità di singole particelle in FOV è sufficientemente bassa affinché ci sia ambiguità piccolo collegamento particelle tra fotogrammi ( campioni della proteina, in generale, sono più inclini all’adsorbimento non specifico per il vetrino coprioggetto di campioni del peptide, e così, il buffer e la densità di potenza per ogni proteina del campione deve essere ottimizzato); 2) il rapporto segnale-rumore di singole particelle è abbastanza alto in modo che la probabilità di falso-identificazione delle particelle è bassa. Ancora, il software può commettere errori occasionali, e si consiglia di ispezione manuale dei dati utilizzando la GUI fornita per valutare le prestazioni del software. In un’applicazione particolarmente sensibile alla rilevazione di falsi positivi traiettoria, parametri di processo, compreso il valore di soglia, minFrames, minTriplets e Chi2stat possono essere impostati più rigorosamente a costo minore sensibilità per l’associazione vera eventi e potenzialmente maggiore bias statistici nella identificazione di traiettoria. Qui condividiamo e descrivere la nostra singola particella software con la speranza di aiutare standardizzare i metodi di analisi di dati e stimolare la discussione sulle procedure consigliate di monitoraggio.
Nel nostro protocollo, che richiede flusso continuo durante imaging per mantenere lo stato allungato il modello di molecole di DNA, il flusso del fluido potrebbe polarizzare il trasporto di alcune proteine lungo modelli di DNA se si diffondono da un meccanismo di salto o se l’idrodinamica raggio il fluoroforo con etichettato è grande22,23. Mentre tale distorsione possa essere misurati e corretti nella maggior parte dei set di dati, il trasporto delle proteine etichettate con un fluoroforo piccolo e diffusione di un meccanismo di scorrimento non è in genere distorte in misura rilevabile di flusso2,4, 24. In particolare, l’impatto della velocità del flusso per il trasporto di proteine lungo del DNA è stato usato per studiare i meccanismi della proteina diffondendo lungo DNA23. A strettamente correlati approccio alternativo che permette di eseguire misure in assenza di flusso utilizza modelli del DNA con biotina a entrambi termini che sono allungati transitoriamente in flusso e vincolato da entrambe le estremità per il coprioggetto tali che le molecole di DNA rimangono in un configurazione estesa quando il flusso è spento25,26,27,28. L’approccio di doppio-tether ha il vantaggio di consentire esperimenti di trasporto privo di flusso ma richiede la modifica di entrambe le estremità delle molecole del DNA modello, controllo di flusso attenti durante il tethering e che caratterizzano le distanze tra i due siti legati. Inoltre, deve essere valutato l’impatto delle tensioni eterogenee e dinamiche conformazionali del DNA attraverso molecole di DNA nel foglio di analisi di singola molecola.
Complessivamente, oltre a studiare la diffusione di 1D delle molecole lungo il DNA, il test come da bilancio singola molecola possa beneficiare molti in vitro biochimiche e studi biofisici a livello di singola molecola, compreso il DNA bersaglio processi di ricerca di proteine, attività enzimatiche sul DNA e altro.
Risoluzione dei problemi
Problema 1: I canali di flusso una perdita.
Soluzione: in primo luogo, assicurarsi che che il design dei canali di flusso consente margine di almeno 1,5 mm per la sigillatura intorno e tra i canali; e poi, durante il montaggio della cella di flusso, assicurarsi che le superfici di contatto tra il vetrino coprioggetto, il nastro biadesivo e la soletta PDMS sono piana, asciutta e priva di detriti, che la pressione è applicata per formare la guarnizione è divisa, e che l’operazione di sigillatura è eseguita a temperatura ambiente.
Problema 2: La densità di DNAs tethered è troppo bassa.
Soluzione: Questo problema si pone quando l’efficienza di funzionalizzazione di PEG è bassa o le molecole del DNA non sono funzionalizzate con biotina. Dalla nostra esperienza, la densità del DNA legato deve essere elevata per > 90% di lamelle preparati freschi o immagazzinato correttamente reagente Silano-PEG-biotina. Nei casi quando la densità del DNA legato è bassa con un batch di comprovata di biotina-λ-DNA, prova d’amplificazione concentrazioni di silano-PEG-biotina durante PEG funzionalizzazione e concentrazioni di streptavidina e biotina-λ-DNA durante la legatura del DNA. Se il problema persiste, sostituire i reagenti PEG e streptavidina.
Problema 3: DNAs stick per il vetrino coprioggetto und non può essere allungato da flusso.
Soluzione: Questo problema può verificarsi anche quando l’efficienza di funzionalizzazione di PEG è bassa ed è aggravato da pH basso dosaggio. Prova che scorre in più BSA o alzando il pH (ad esempio a 8.0) per contribuire a sopprimere l’adsorbimento di DNA alla superficie (punto 4.3.2). Se adsorbimento di DNA è un problema persistente in una condizione di particolare test, prova compreso fino a 90% Silano-PEG-COOH durante PEG funzionalizzazione.
Note di analisi di dati:
Utilizziamo personalizzata singola particella software di monitoraggio per identificare traiettorie di singole molecole di diffusione lungo il DNA, da cui loro costanti di diffusione 1D, D1 sono stimati. Per migliorare l’analisi dei dati, abbiamo implementato l’ algoritmo di simmetria radiale18 per la localizzazione di particelle e la covarianza-based estimator19 per stimare le costanti diffusione 1D, velocizzato notevolmente l’analisi dei dati senza compromettere precisione. Abbiamo precedentemente validato il software personalizzato analizzando dati simulati11. I passaggi principali sono descritti di seguito.
Identificazione di particelle:
Questo passaggio è per il rilevamento e segmentazione particelle – macchie di diffrazione limitata – da sfondo. In primo luogo, spazialmente passa-banda filtrare le immagini per migliorare il segnale delle particelle nel 3-5 intervallo di pixel (che corrisponde alla dimensione della funzione punto di diffusione sul nostro sistema) e quindi basato sull’intensità di soglia (vedere script: spt2_SD_sandbox.m).
Assegnazione di centroide
Segmentazione dell’immagine, si localizza solo molecole a livello di pixel risoluzione spaziale. Per localizzare le molecole con una precisione molto maggiore, è possibile impiegare la simmetria radiale super risoluzione algoritmo18 immagini filtrata come sopra. (Questo metodo si basa su un calcolo analitico e così notevolmente riduce il carico computazionale rispetto ad altri metodi popolare ad alta precisione come una giunzione gaussiana 2D (vedere script: spt2_SD_sandbox.m).)
Particella di rilevamento:
Per tenere traccia la traiettoria di una particella attraverso il tempo, dobbiamo ri-individuare le stesse particelle che si muovono tra i fotogrammi. Consideriamo le fasi di iniziazione, lampeggiante e terminazione di essere componenti di una traiettoria. Abbiamo vincolare sollevatore di particelle in frame correnti a quelli visualizzati nei frame precedenti dallo spostamento massimo consentito per ogni frame. In casi dove sono possibili collegamenti multipli, viene utilizzato l’algoritmo di Jonker-Volgenant per produrre set di collegamento ottimale a livello globale (vedere script: traceTraj4_kx.3.m).
Stima di D1:
Per stimare i valori D1 da traiettorie, usiamo la covarianza-Based Estimator (CVE)19. Basato su un calcolo analitico, questo metodo è più computazionalmente efficiente e statisticamente rigorosa rispetto altri metodi come la regressione degli spostamenti quadrati medi comunemente usati (vedere script: runspt5_SD.m).
Traiettoria di filtraggio:
Alcune traiettorie contengono artefatti quali sollevatore a molecole di superficie associato e devono essere rimossi. Abbiamo implementato diverse funzionalità come minimo spostamento parallelo al DNA, massimo spostamento trasversa al DNA, lunghezza minima di traiettoria, numero minimo di posizioni tripletta consecutiva rilevato e il Punteggio di probabilità minima (Vedi Xiong et al11 per definizione) che possono essere filtrati per isolare un set minimamente distorto delle traiettorie probabile rappresentare molecole diffondere sul DNA (vedere script: sptViewFig2_update3x.m).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Tony Kulesa, Robin Kirkpatrick ed Evangelos Gatzogiannis per assistenza con l’installazione iniziale di strumentazione e test. Ringraziamo ulteriormente Tony Kulesa significativo aiuto scrivendo e valutare la singola particella su misura, software di monitoraggio. Questo lavoro è stato sostenuto dal finanziamento di avvio e un premio alla carriera all’interfaccia scientifica (per PCB) della Burroughs Wellcome Foundation.
Materials
| Biotin labeled oligo, 5’-AGGTCGCCGCCC(A)20-biotin-3’ | IDT | Custom oligo synthesis | Standard desalting purification is sufficient |
| λ-DNA | New England Biolabs Inc. | N3011S | Make aliquots and minimize freeze-thaw cycle number |
| T4 DNA ligase and ligation reaction buffer | New England Biolabs Inc. | M0202S | |
| Amicon centrifugal filter tubes with NMWL of 100k Dalton | EMD Millipore | UFC510008 | |
| No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-106 | |
| Pure ethanol | VWR | 89125-186 | |
| Potassium hydroxide pellets | Fisher Scientific | P250-500 | |
| Plasma cleaner, model No. PDC-32G | Harrick Plasma | ||
| Silane-peg-biotin | Nanocs | PG2-BNSL-5k | Store at -20oC in dry nitrogen gas |
| A CAD software | Autodesk | AutoCAD | |
| Double-adhesive tape | Adhesive Applications | 8512-2-DP/DL | |
| Tape cutter, model No. CE5000-40-CRP | Graphtec America | ||
| PDMS and crosslink reagent kit | R.S. Hughes | RTV615 CLEAR 010 | |
| Degassing chamber, model No. F42010-0000 | BEL-ART Products | ||
| Mixer, model No. ARV-310 | Thinky | ||
| Hole puncher, Harris Uni-Cores, Size 0.5 mm | Harris Uni-Cores | This can be substituted with a manual biopsy punch with a similar needle size | |
| Tygon tubing | Cole Parmer | EW-06420-02 | 0.020" ID, 0.060"OD |
| Peek tubing | Western Analytical | PK007-031-Y | 0.007" ID, 0.031"OD |
| Streptavidin | New England Biolabs Inc. | N7021S | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs Inc. | B9000S | |
| Sytox orange nucleic acid stain | Invitrogen | S11368 | |
| Ti-E Microscope | Nikon | Microscope, camera, objective, dichroic mirror and bandpass filter can be substituted for similar equipment | |
| 100x Objective, NA/1.49, CFI Apo TIRF | Nikon | ||
| CMOS camera | Hammamatsu | Orca Flash 4.0 | |
| Dichroic mirror | Semrock | FF560/659-Di01-25×36 | |
| Bandpass filter | Semrock | FF560/659-Di01-25×36 | |
| 532 nm laser | Rayscience Innovation Limited, Shanghai | OEMLL-FN-532nm-C | Select wavelength to correspond to stain of choice |
| Syringe pump | Chemxy | Fusion 200 | |
| TMR-KRRR, >=85% purity | MIT Biopolymer lab | ||
| pVIc-Cy3B, HPLC purified | A gift from Dr. Walter Mangel at Brookhaven National lab | ||
| Script programming software | MathWorks | Matlab | |
| * see parts list for solenoid valves, computer interface, and assembly instructions at: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers |
References
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