Einfach, Robust und hohen Durchsatz Molekül fließen Stretching Assay-Implementierung für das Studium Transport von Molekülen entlang DNA

1. Vorbereitung der Biotin-λ-DNA Hinweis: Biotin-λ-DNA-Moleküle sind bereit, durch Ligation eine Biotin-markierten Oligonukleotid, 5 '-AGGTCGCCGCCC(A) 20 – Biotin – 3 ', Λ-DNA Moleküle 20. Prepare 0,1 mM Biotin beschriftet Oligo in TE-Puffer. Wärme 0,5 mg/mL λ-DNA Lager bei 65 ° C für 60 s und Sprung in nassem Eis sofort. Hinweis: Schnelle Quench Kühlung reduziert λ-DNA-Concatemerization. Pipette 100 µL der λ-DNA-Lösung zu einem Microcentrifuge Schlauch. Add 1 µL 0.1 mM Oligo in 9 µL TE-Puffer. Add 2 µL der Oligo-Lösung für den Microcentrifuge Schlauch mit λ-DNA. Gründlich mischen. Hinweis: Oligo ist in etwa eine 12-fold Molaren Überschuss über ergänzende λ-DNA Ende. Erhitzen Sie die Mischung der λ-DNA/Oligo bei 65 ° C für 60 s. Langsam die Mischung auf Raumtemperatur abkühlen. Hinweis: In diesem Schritt können die Oligo bis zu ergänzenden λ-DNA Ende Tempern. Legen Sie die Mischung auf dem Eis. Fügen Sie 11 µL T4 DNA-Ligase Reaktion Puffer (endgültige Puffer Konzentration 1 X). Mischen Sie vorsichtig. Fügen Sie 2 µL (800 Stück) T4 DNA-Ligase-Enzym. Vorsichtig mischen. Inkubieren Sie die Mischung für 2 h bei 16 ° C oder über Nacht bei 4 ° c Reinigen Sie das Produkt mit zentrifugalen Filterschläuche mit einem nominalen Molekulargewicht Limit von 100 kDa. Insbesondere übertragen die Schritt 1,9-Mischung in eine zentrifugale Filter Schlauch und Zentrifuge bei 14.000 x g für 5 min, mit 400 µL TE-Puffer zweimal waschen und sammeln das gereinigte Produkt. Hinweis: Die als gereinigt Biotin-λ-DNA in TE-Puffer sind stabil bei-20 ° C bis zu einem Jahr. 2. Deckglas Funktionalisierung Hinweis: Glasdeckgläser sind durch die Reaktion mit Silan-PEG-Biotin funktionalisiert. Diese einstufige Reaktion Protokoll ist einfacher und zuverlässiger erfahrungsgemäß als standard zweistufige Reaktion Protokoll 20. Deckglas Funktionalisierung mit Silan-PEG-Biotin schafft Bindungsstellen für Streptavidin und minimiert die unspezifische DNA und Protein Adsorption an der Oberfläche des Deckglases. Sonicate fünf Nr. 1 Deckgläsern in 95 % igem Ethanol im Inneren eine Färbung jar für 10 min und dann mit Reinstwasser dreimal ausspülen. Hinweis: Die fünfte Deckglas bietet einen Ersatz bei Bruch. Füllen Sie die Färbung Glas mit 1 M KOH, 10 min. lang beschallen und dann spülen Sie mit Reinstwasser dreimal. 2.1-2.2 Zyklus zweimal wiederholen. Trocknen Deckgläsern unter trockenen, sauberen Gasstrom der N 2. Weitere reinigen und trocknen Sie die Deckgläsern durch Luft Plasmabehandlung bei 900 mTorr Druck für 5 min. Brüten Deckgläsern mit 25 mg/mL Silan-Peg-Biotin speziell in 95 % igem Ethanol bei Raumtemperatur für 2 h aufgelöst, sandwich-50 µL Silan-Peg-Biotin Lösung zwischen zwei sauberen und trockenen Deckgläsern und inkubieren Sie das Deckglas " Sandwiches " innerhalb einer geschlossenen Pipette Tip Box mit ca. 10 mL Wasser an der Unterseite (nicht in Kontakt mit den Deckgläsern) Lösungsmittel verdampfen zu minimieren. Waschen entfernt überschüssige PEG Molekülen mit Reinstwasser und Trocknen der PEG Deckgläsern unter sauberen beschichtet trocknen Gasstrom N 2. Hinweis: Die funktionalisierten Deckgläsern können bis zu drei Tage unter Umgebungsbedingungen gelagert werden. 3. Bau der Zelle fließen Hinweis: Durchflusszellen entstehen durch sandwiching eine Doppel-Klebeband mit vorgestanzten Kanäle zwischen eine PEG funktionalisiert Deckglas und ein PDMS-Platte mit Einlass und Auslass Öffnungen. Mehrere Kanäle fließen pro Durchflusszelle. Strömungskanäle in einer CAD-Software-design und Schnitt die Kanäle (Breite, Tiefe und Länge der einzelnen Kanäle sind 1, 0,13 und 12 mm, beziehungsweise) auf ein Doppel-Klebeband mithilfe einer Bandabschneider (in der Regel acht Kanäle fließen pro Zelle). Entfernen Sie Klebeband Residuen der Strömungskanäle bilden. Zu PDMS Platten, mischen Sie 45 g PDMS mit 5 g Vernetzung Reagenz (genug für die Herstellung von zwölf 5 mm dicker PMDS Platten die unter Umgebungsbedingungen auf unbestimmte Zeit gespeichert werden kann) mit einem Mixer, den Teig in zwei 10 cm Petrischalen und lassen die Gerichte in einer Vakuumkammer bis im Wesentlichen alle Luftblasen sind verschwunden (manuell entfernen Luftblasen, wenn irgendwelche bleiben, wenn die Gerichte aus der Vakuumkammer entfernt werden). Übertragen Sie dann die Gerichte in einem Ofen 80 ° C bis PDMS erstarrt (ca. 2 h). Schneiden Sie ein PDMS-Platte, die die Größe der Doppel-Klebeband mit vorgestanzten Kanälen entspricht. Peel ein Schutzfilm aus dem Doppel-Klebeband und halten den Film auf eine Ebene Fläche der Platte PDMS. Ablauf und Zulauf Lochen auf der PDMS-Platte mit einem 23 Gauge-Nadel eine Biopsie Loch-Puncher. Schälen die zweite Schutzfolie aus dem Doppel-Klebeband und halten die PDMS-Band Montage an die funktionalisierten Oberfläche das Deckglas (stellen Sie sicher, dass das Deckglas flach ist. Sehen ein Bild von einer fertig montierten Durchflusszelle in Abbildung 1a). 4. Imaging-TIRF Hinweis: Biotin-λ-DNA sind angebunden an eine Flow-Kanal-Oberfläche und Laminar-Flow gilt für Flow erstrecken sich die DNA-Moleküle ( Abbildung 1 b). Die > 80 % gedehnt DNA Moleküle dienen als räumlich erweiterte Vorlagen für die Bindung und den Transport Aktivität Eindringmittel beschrifteten Moleküle zu beobachten. Die Bahnen der einzelnen Moleküle werden verfolgt von Time-Lapse TIRF Imaging ( Abbildung 1 c & e). Fix der Messzelle am Mikroskop Bühne und Last bereits entgast leeren Puffer (10 mM Natriumphosphat, 2 mM NaCl, 50 µM EDTA, 20 mM Ethanol, 5 % (V/V) Glycerin, 0,01 % Tween-20, 1 % (V/V) β-Mercaptoethanol, pH 7,4), 0,2 mg/mL Streptavidin Lösung, 1 mg / mL Bovine Serum Albumin (BSA) und 100 pM Biotin-λ-DNA-Lösung in vier Stauseen, dass jeweils ein Tygon-Schlauch mit einem Magnetventil-Wert verbunden und eine PEEK-Schlauch durch Sleeven den Tygon-Schlauch über die kleineren PEEK Rohr (ein weiteres Tygon Schlauch verbunden verhindert Rückfluss von Reagenzien). Entgasen von Kleinmengen des Puffers durch Übernachtung Exposition, Vakuum oder kürzeren Exposition gegenüber Vakuum unter Rühren (bis Bläschen nicht mehr sichtbar sind). PEEK-Schläuche des leeren Puffer Reservoirs in einer Bucht Loch der Durchflusszelle einfügen Prime den Kanal fließt in leeren Puffer, und drei andere PEEK-Schlauch In Saugbohrungen ist der Luftdruck angetrieben von Energiefluss jedes Reagenz durch Magnetventile gesteuert und vollautomatisch über ein Computer-Skript einfügen. Achten Sie darauf, keine Luft Blasenbildung im Kanal zu induzieren. Schließen Sie ein Tygon-Schlauch mit einer kurzen PEEK Schläuche aus der Austrittsöffnung zu einem Abfallbehälter. Der kurze Blick Schlauch am Ausgang hilft Luft Blasenbildung während der Infusion zu unterdrücken, durch die Aufrechterhaltung der Überdruck im Inneren des Kanals. Tethering Biotin-λ-DNA-Moleküle zu einer Strömung Kanal Oberfläche. Flow in 0,2 mg/mL Streptavidin Lösung, 5 min inkubieren und fließen dann in leere Puffer zum Auswaschen der ungebundenen Streptavidin. Durchfluss bei 1 mg/mL BSA-Lösung 1 min inkubieren und fließen dann in leere Puffer zum Auswaschen der ungebundenen BSA. Hinweis: BSA weiter unterdrückt DNA und Probe Adsorption an der Oberfläche. Flow in 100 pM Biotin-λ-DNA-Lösung, 10 min inkubieren und fließen dann in leere Puffer zum Auswaschen der ungebundenen DNAs. Hinweis: Nachdem die DNA an die Oberfläche gebunden ist, vermeiden Sie schnelle fließt die gefesselte DNA-Moleküle beschädigt. Um die Qualität der funktionalisierten Deckglas, fließen in DNA Färbung Farbstoff wie Sytox orange unter der Assay-Bedingungen verwendet werden (siehe 4.6 unten), und starten Sie Fluoreszenz imaging unter 532 nm Laser Beleuchtung. Hinweis: Die Qualität der funktionalisierten Deckglas ist in der Regel gut, und die Dichte der Strömung gestreckt DNA-Moleküle wird hoch sein. Es ist wichtig, hochdichte der Fluss erstreckte sich DNA-Moleküle haben, dass DNA-Bindung und Schiebe/1D Verbreitung Ereignisse beobachtet werden können. Feinabstimmung den TIRF Winkel zum besten Signal Rauschabstand von Bildern der gestreckten DNA-Moleküle ( Abbildung 1-d) zu erreichen. Bahnen der einzelne Moleküle DNA, voran aufzeichnen wiederholen Sie die Schritte 4.2-4.4 in einen neuen Kanal (ohne DNA Farbstoff Färbung), dann ziehen bereits entgast Sub-nanomolaren Fluorophore beschriftet Moleküle mit einer genug hohen Durchflussrate mithilfe einer Spritzenpumpe und sammeln Sie Zeitraffer Fluoreszenzbilder mit einer Frame-Rate von 100 Hz. Hinweis: Eine Durchflussmenge entspricht einem Weissenberg-Zahl (Wi: die dimensionslose Produkt die längste Polymer-Relaxationszeit – ca. 0,2 s für λ-DNA- und die Scherrate – die Veränderung der Strömungsgeschwindigkeit mit Abstand von der Oberfläche des Deckglases) von 500 innerhalb der Kanal wird für die Einzelmolekül-Bildgebung mit einer Frame-Rate von 100 Hz 21 empfohlen. Sammeln 10.000 Bilder in einem Field Of View (FOV), einen Film zu produzieren und ähnliche Filme aus mehreren (in der Regel zehn) FOVs pro Probe zu sammeln. Hinweis: Die Dichte der Partikel in einem FOV sollte weder zu hoch – das wird Datenanalyse erschweren, indem man Objektzuordnung in Frames nicht eindeutig noch zu niedrig – die zu geringe Auftreten von Einzelmolekül-Veranstaltungen auf DNA führen könnte. Die Beleuchtungsintensität so optimieren, dass Moleküle gebunden an das Deckglas Oberfläche sind schnell Foto-gebleicht, Hintergrund zu unterdrücken, während Moleküle diffundieren auf DNA nicht vorschnell gebleicht werden, so dass längere Trajektorien erkannt werden können. Hinweis: Wir verwenden in der Regel 200-800 W/cm 2 Leistungsdichte in der FOV. Am Ende des Schrittes 4.6 Infusion DNA Farbstoff Färbung zu bestätigen, dass DNA-Moleküle noch Strömung gestreckt werden können. Laufen sowohl positive als auch negative Kontrollproben. Hinweis: Eine gute positive Kontrolle ist ein Tetrapeptid, TetraMethylRhodamine (TMR)-KRRR (TMR ist gekoppelt an das N-terminale Amin) hat eine mittlere 1D Verbreitung konstante 10,5 ± 0,7 (Standardfehler) M (bp- 2/s) bei neutralem pH 11. Eine gute Negativkontrolle ist beschriftete Proben von Interesse in Testpuffer in einem Kanal zu messen, die hat keine DNA angebunden, wo keine Diffusion auf DNA-Aktivität erkannt werden sollten. 5. Datenanalyse: Hinweis: eine benutzerdefinierte Einzelkorn-Tracking-Software wird verwendet, um die Bahnen der einzelnen Moleküle diffundieren entlang DNA erkennen und schätzen Verbreitung Konstanten. Diese Software ermittelt zunächst Zentroid Positionen der einzelnen Partikel mit hoher Genauigkeit, Partikel, die auf das Deckglas Oberfläche geklebt sind identifiziert und dann links Partikel in verschiedenen Frames Time-Lapse Trajektorien bilden. Aus diesen Bahnen werden die 1D Verbreitung konstanten geschätzt. Zur Datenanalyse zu starten, öffnen Sie eine scripting Software (siehe Tabelle der Materialien) und gehen Sie zum Verzeichnis der einzelnen Partikel tracking-Software. Öffnen Sie das Skript mit dem Namen " largedataprocess3.m ". Ein wichtiger Parameter definiert werden, ist der Schwellenwert für einzelne Partikeldetektoren. Zu bestimmen, die optimale Schwellwert, laufen die " Determine_threshold_value.m " Skript. Dieses Skript zeigt wie der Schwellenwert einzelner Partikeldetektoren auswirkt. Nach der Bestimmung des optimalen Schwellenwerts, laufen die " largedataprocess3.m " Skript Nach Abschluss der einzelnen Partikels tracking-Analyse, filtern die rohen Flugbahnen durch Ausführen der " Trajectory_filtering.m " Skript. Eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) basiert der Filterung Schritt zu visualisieren. Auf die GUI-Panel setzt die minimale Verschiebung entlang DNA, MinXDisp, auf 2 Pixel soll die maximale Verschiebung quer zur DNA, MaxYDisp, 2 Pixel die minimale Anzahl der Frames, MinFrames, auf 10 festgelegt; minimale Anzahl der Staaten von Triplett, MinTriplets, um 10; Geben Sie die minimale Diffusion konstante entlang DNA, D_par, 0; Geben Sie die maximale geschätzte Verbreitung Konstante, DNA, D_trans, auf 10 M (bp 2) S -1 quer; der minimale statistische Parameter, Chi 2 _stat auf-5 festgelegt; Legen Sie das minimale Verhältnis der Verschiebung entlang der DNA, die quer zur DNA, MinX/Y, 2. Hinweis: Alle rohe Flugbahnen, die diese Filterung Parameter übergeben sind in Tabelle 1 aufgeführt, und diejenigen, die nicht in Tabelle 3 aufgeführt sind. Klicken Sie auf eine Flugbahn Nummer in der Tabelle 1, die Flugbahn wird in Grafik 1 verdrängt & 2. Klicken Sie auf die " Play " der rohen Fluoreszenzbilder abzuspielen. Klicken Sie auf die " Add_to_Table2 ", die Flugbahn als ein einzelnes Molekül Schiebe-Flugbahn zu identifizieren. Am Ende werden alle Trajektorien zu Tabelle2 hinzugefügt gespeichert werden, beim Schließen der GUI. , Berechnen Sie die durchschnittliche Verbreitung konstanten, führen Sie das Skript " Calculate_mean_diffusion_constant.m ". Die durchschnittliche Verbreitung konstante beläuft sich aus der Menge der Flugbahnen, die haben alle Filter Schritte bestanden und wurden hinzugefügt, Tabelle 2.