Une seule molécule Simple, robuste et haut débit débit étirement test mise en place pour étudier le Transport de molécules le long de l’ADN

1. préparation de l’ADN-λ-biotine Remarque : biotine-λ-DNA molecules sont préparés en ligaturant un oligonucléotide marqué biotine, 5 '-AGGTCGCCGCCC(A) 20 – biotine – 3 ' à Λ-ADN molécules 20. Prepare 0,1 mM biotine étiquetés oligo en tampon TE. Chaleur 0,5 mg/mL λ-ADN stock à 65 ° C pendant 60 s et plonger dans la glace mouillée tout de suite. Remarque : Une trempe rapide refroidissement réduit λ-ADN concatemerization. Pipette 100 µL de la solution de λ-ADN dans un tube de microcentrifuge. Ajouter 1 µL de l’oligo de 0,1 mM en 9 µL de tampon TE. Ajouter 2 µL de la solution d’oligo dans le tube de microcentrifuge contenant l’ADN de λ. Mélanger soigneusement. NOTE : Oligo est présent dans environ un excès molaire 12-fold au-dessus de l’extrémité de λ-ADN complémentaire. Chauffer le mélange de λ-ADN/oligo à 65 ° C pendant 60 s. Refroidir lentement le mélange à température ambiante. Remarque : Cette étape permet les oligo de recuire à la fin de λ-ADN complémentaire. Placer le mélange sur la glace. Ajouter 11 µL de tampon de réaction T4 DNA ligase (concentration finale tampon 1 x). Mélanger doucement. Puis ajoutez 2 µL (800 unités) de l’enzyme de T4 DNA ligase. Mélanger doucement. Incuber le mélange pendant 2 h à 16 ° C ou une nuit à 4 ° C. Purifier le produit à l’aide de tubes filtre centrifuge avec une limite de poids moléculaire nominal de 100 kDa. Plus précisément, transvaser le mélange étape 1.9 dans un tuyau filtre centrifuge et centrifuger à 14 000 x g pendant 5 min, laver deux fois avec 400 µL de tampon de TE et recueillir le produit purifié. Remarque : Les purifiés comme biotine-λ-ADN dans un tampon TE sont stables à-20 ° C jusqu’à un an. 2. Fonctionnalisation de la lamelle couvre-objet Remarque : lamelles de verre sont fonctionnalisés en réagissant avec le silane-PEG-biotine. Ce protocole de réaction en une seule étape est plus simple et plus fiable dans notre expérience que le standard en deux étapes réaction protocole 20. Fonctionnalisation de la lamelle couvre-objet avec silane-PEG-biotine crée des sites de liaison pour la Streptavidine et minimise l’ADN non spécifique et adsorption de protéine à la surface de la lamelle couvre-objet. Sonicat cinq lamelles de n ° 1 dans l’éthanol à 95 % à l’intérieur d’une coloration jar pendant 10 min et puis rincez avec de l’eau ultrapure pour trois fois. Remarque : La lamelle cinquième offre une pièce de rechange en cas de bris. Remplissez le bol coloration avec 1 M KOH, laisser agir pendant 10 min et puis rincez avec de l’eau ultrapure triple. Répéter deux fois le cycle de 2.1-2.2. Sécher les lamelles couvre-objet en écoulement de gaz sec et pur N 2. De plus, nettoyer et sécher les lamelles couvre-objet en appliquant le traitement plasma air à pression mTorr 900 pendant 5 min. Incuber des lamelles couvre-objet avec 25 mg/mL silane-peg-biotine dissous dans l’éthanol à 95 % à température ambiante pendant 2 h. plus précisément, “sandwich” de 50 µL de solution de silane-peg-biotine entre deux lamelles couvre-objet propre et sec et incuber la lamelle " sandwichs " à l’intérieur d’une boîte de pointe de pipette fermée avec environ 10 mL d’eau en bas (pas en contact avec les lamelles) pour minimiser l’évaporation des solvants. Laver les excès PEG molécules avec de l’eau ultrapure et sécher la cheville enduite lamelles sous propre sec débit de gaz 2 N. Remarque : Les lamelles fonctionnalisés peuvent être conservés jusqu’à trois jours dans des conditions ambiantes. 3. Construction de cellule de flux Remarque : cellules d’écoulement sont construites en intercalant un double-adhésif prédécoupé voies entre une cheville fonctionnalisés lamelle couvre-objet et une dalle PDMS contenant des trous d’entrée et de sortie. Plusieurs canaux sont intégrés par la cellule d’écoulement. Concevoir des canaux d’écoulement dans un logiciel de CAO et de couper les canaux (la largeur, la profondeur et la longueur de chaque canaux sont 1, 0,13 et 12 mm, respectivement) sur un ruban adhésif double face à l’aide d’un coupe-ruban (généralement huit canaux est intégrés par la cellule d’écoulement). Enlever les résidus de ruban pour former les canaux d’écoulement. Pour faire des galettes PDMS, bien mélanger 45 g de PDMS avec 5 g de réactif de réticulation (assez pour faire douze 5 mm épais PMDS dalles qui peuvent être conservés indéfiniment dans des conditions ambiantes) à l’aide d’un mixeur, versez le mélange dans deux plats de Pétri de 10 cm et laisser le plats à l’intérieur d’une chambre à vide jusqu’à ce qu’essentiellement toutes les bulles d’air ont disparu (manuellement enlever les bulles d’air si tout reste lorsque les plats sont retirés de la chambre à vide). Puis placer les boîtes dans une étuve à 80 ° C jusqu’à ce que le PDMS se solidifie (environ 2 h). Découper une dalle PDMS qui correspond à la taille du ruban adhésif double face avec chaînes pré découpés. Peel protection un film hors du ruban adhésif double face et respecte le film à une face plane de la dalle PDMS. Percer les trous de sortie et d’entrée sur la dalle PDMS utilisant un biopsie-perforateur avec une aiguille de calibre 23. Pelez le second film de protection sur le ruban adhésif double face et adhérer à l’Assemblée de PDMS-ruban à la surface fonctionnalisée de la lamelle (s’assurer que la lamelle est plate. Voir une photo d’une cellule de flux entièrement assemblé dans la Figure 1 a). 4. FRBR Imaging Remarque : biotine-λ-ADN est attachés à une surface de canal d’écoulement et flux laminaire est appliquée aux flux étirer les molécules d’ADN ( Figure 1 b). Le > 80 % s’étendait serve de molécules de l’ADN en tant que modèles spatialement étendus pour observer l’activité de transport et de liaison des molécules fluorescent étiquetés. Les trajectoires des molécules simples sont suivies par l’imagerie FRBR Time-lapse ( Figure 1C & e). Fix la cellule de flux sur un microscope stade et charge préalablement dégazé sous vide tampon (phosphate de sodium 10 mM, 2 mM NaCl, 50 µM EDTA, éthanol de 20 mM, 5 % (v/v) de glycérol, 0,01 % de Tween-20, 1 % (v/v) de β-mercaptoéthanol, pH 7,4), 0,2 mg/mL de solution de streptavidine, 1 mg / mL de solution d’albumine sérique Bovine (BSA) et solution de biotine-λ-ADN 100 pM dans quatre réservoirs que chacun un tuyau Tygon connectées à une valeur de solénoïde et un autre Tygon tube relié à un tube PEEK par gaine tuyau Tygon sur le plus petit (de tube PEEK empêche les reflux de réactifs). Dégazer petits volumes de mémoire tampon par exposition au jour le jour de passer l’aspirateur ou plus court à vide avec agitateurs (jusqu’à ce que les bulles ne sont plus visibles). Insérer le tube PEEK du réservoir tampon vide dans le trou d’une entrée de la cellule de flux. Amorcer le canal en s’écoulant dans un tampon vide, puis insérez trois autres tubes de PEEK dans des trous d’entrée la pression de l’air axé sur le débit de chaque réactif est contrôlée par des électrovannes et entièrement automatisée via un script ordinateur. Veillez à ne pas induire la formation de bulles d’air dans le canal. Connecter un tuyau Tygon avec un court tube PEEK de l’orifice de sortie d’un conteneur à déchets. Le tube court de PEEK à la sortie permet de supprimer la formation de bulles d’air lors d’une perfusion en maintenant une pression positive à l’intérieur du canal. Biotine-λ-ADN molécules pour une surface de canal d’écoulement de tethering. Débit de 0,2 mg/mL de solution de streptavidine, incuber pendant 5 min et puis couler dans un tampon vide laver par la Streptavidine unbound. Flux en solution de 1 mg/mL de BSA, incuber pendant 1 min et puis couler dans un tampon vide laver par la BSA unbound. Remarque : Outre les BSA supprime ADN et échantillon d’adsorption à la surface. Flux en solution de biotine-λ-ADN 100 pM, incuber pendant 10 min et puis couler dans un tampon vide de laver les ADN indépendants. Remarque : Après que l’ADN est lié à la surface, éviter les flux rapides pour ne pas endommager les molécules d’ADN captifs. Pour vérifier la qualité de la lamelle fonctionnalisée, coulent dans ADN coloration teinture comme Sytox orange dans les conditions de test à utiliser (lire 4.6 ci-dessous) et commencer à fluorescence imaging éclairage de laser moins 532 nm. NOTE : La qualité de la lamelle fonctionnalisée est généralement bonne et la densité des molécules d’ADN de flux tendu sera élevée. Il est essentiel d’avoir une densité assez élevée des molécules d’ADN de flux tendu afin que la fixation à l’ADN et les événements de glissement/1D diffusion peuvent être observés. Fine tune l’angle de la FRBR pour obtenir le meilleur rapport signal sur bruit d’images étirées des molécules d’ADN ( Figure 1D). Pour enregistrer les trajectoires des molécules simples se déplaçant le long de l’ADN, répétez les étapes 4.2-4.4 à l’intérieur d’un nouveau canal (sans ADN coloration teinture), puis laisser infuser préalablement dégazé sub-nanomolaires fluorophore étiqueté de molécules à un débit assez élevé à l’aide d’un pousse-seringue et recueillir des images de fluorescence Time-lapse avec une cadence de 100 Hz. Remarque : Un débit équivalent à un certain nombre de Weissenberg (Wi : le produit sans dimension de la plus longue période de relaxation polymère – environ 0,2 s pour λ-ADN – et la vitesse de cisaillement – le changement de vitesse d’écoulement avec la distance de la surface de la lamelle couvre-objet) de 500 à l’intérieur de la canal est recommandé pour l’imagerie de la molécule unique avec une cadence de 100 Hz 21. Recueillir 10 000 images dans un champ de vision (FOV) pour produire un film et recueillir les films similaires de multiples FOVs (généralement dix) par exemple. Remarque : La densité des particules unique dans un champ de vision doit être ni trop haut – qui va compliquer l’analyse des données en effectuant l’assignation d’objet sur trames ambigus, ni trop faibles – qui pourrait conduire à faible occurrence des événements de la molécule ADN. Optimiser l’intensité de l’éclairage de sorte que les molécules liés la surface de la lamelle couvre-objet sont photo-blanchis rapidement pour supprimer l’arrière-plan tandis que les molécules diffusant sur l’ADN sont blanchis pas trop vite pour que des trajectoires plus longues peuvent être détectées. Remarque : Nous utilisons généralement densité de puissance de 200-800 W/cm 2 dans la FOV. à la fin de l’étape 4.6, infuser coloration teinture de l’ADN pour confirmer que les molécules d’ADN peuvent encore être flux-tendu. Exécuter les deux échantillons témoins positifs et négatifs. Remarque : Un bon contrôle positif est un tétrapeptide, tétraméthylrhodamine (TMR)-KRRR (TMR est couplé à l’aminé N-terminal) qui a une constante de diffusion D 1 moyenne de 10,5 ± 0,7 (erreur standard) M (bp 2/s) à pH neutre, 11. Un bon contrôle négatif est de mesurer des échantillons étiquetés d’intérêt dans du tampon dans un canal qui n’a aucun ADN attaché, où aucune activité de diffusion sur ADN devrait être détectée. 5. Analyse des données : Remarque : une seule particule personnalisée dépistant le logiciel est utilisée pour identifier les trajectoires des molécules simples diffusant le long de l’ADN et estimer les constantes de diffusion. Ce logiciel détermine d’abord les positions du centre de gravité des particules unique avec une grande précision, identifie les particules qui sont collées sur la surface de la lamelle couvre-objet et puis lie les particules dans des cadres différents pour former des trajectoires Time-lapse. De ces trajectoires, les constantes de diffusion 1D sont estimées. Pour démarrer l’analyse des données, ouvrez un logiciel de script (voir table des matières) et allez dans le répertoire de la particule unique logiciel de suivi. Ouvrez le script nommé " largedataprocess3.m ". Un paramètre important à définir est la valeur seuil de détection de la particule. Exécutez pour déterminer la valeur de seuil optimal, le " Determine_threshold_value.m " script. Ce script vous indiquera comment la valeur de seuil affecte la détection de particules unique. Après avoir déterminé la valeur de seuil optimale, exécutez le " largedataprocess3.m " script à l’issue d’une seule particule suivi analyse, filtrer les trajectoires brutes en exécutant le " Trajectory_filtering.m " script. Une Interface d’utilisateur graphique (GUI) est intégré à visualiser l’étape de filtrage. Panneau de sur l’interface graphique, affectez le déplacement minimal le long de l’ADN, MinXDisp, 2 pixels affectez le déplacement maximal transversal à l’ADN, MaxYDisp, 2 pixels ; la valeur le nombre minimal d’images, minFrames, 10 ; le nombre minimal d’États de triplet, minTriplets, la valeur 10 ; la valeur de la constante de diffusion minimale le long de l’ADN, D_par, 0 ; définir la constante de diffusion estimée maximal transversal à l’ADN, D_trans, à 10 M (bp 2) S -1 ; la valeur du paramètre statistique minimal, Chi 2 _stat, -5 ; Fixez le ratio minimal des déplacements le long de l’ADN à cette transversale à l’ADN, MinX/Y, 2. Remarque : Toutes les trajectoires brutes qui passent ces paramètres de filtrage sont répertoriés dans le tableau 1, et ceux qui ne sont pas répertoriés dans le tableau 3. Clic sur une trajectoire numéro dans le tableau 1, la trajectoire sera déplacée dans les graphiques 1 & 2. Cliquez sur le " Play " bouton pour lire les images brutes de fluorescence. Cliquez sur le " Add_to_Table2 " pour identifier la trajectoire comme une seule molécule coulissant de trajectoire. En fin de compte, toutes les trajectoires ajoutés à Table2 seront enregistrées lors de la fermeture de l’interface GUI. Pour calculer les constantes de diffusion moyenne, exécutez le script " Calculate_mean_diffusion_constant.m ". La constante de diffusion moyenne est estimée à partir de l’ensemble des trajectoires qui ont passé toutes les étapes de filtrage et été ajoutées au tableau 2.