Een eenvoudige, robuuste en hoge doorvoer enkel molecuul Flow uitrekkende Assay uitvoering voor de studie van vervoer van moleculen langs DNA

1. voorbereiding van biotine-λ-DNA Opmerking: Biotine-λ-DNA-moleculen worden voorbereid door een Biotine-geëtiketteerden oligonucleotide, 5 ligating '-AGGTCGCCGCCC(A) 20 – Biotine – 3 ' aan Λ-DNA moleculen 20. Voorbereiden 0.1 mM Biotine label oligo in TE buffer. Warmte 0,5 mg/mL λ-DNA voorraad bij 65 ° C gedurende 60 s, en duik in nat ijs rechtsweg. Opmerking: Snelle demping koeling vermindert λ-DNA concatemerization. Pipetteer 100 µL van de λ-DNA-oplossing in een buis microcentrifuge. Voeg 1 µL van de oligo 0.1 mM in 9 µL van TE buffer. Toevoegen 2 µL van de oligo-oplossing aan de buis van de microcentrifuge met de λ-DNA. Meng. Opmerking: Oligo is aanwezig in ongeveer een 12-fold molaire overschrijding van het einde van de λ-cDNA. Verwarm het mengsel van de λ-DNA/oligo bij 65 ° C gedurende 60 s. Langzaam het mengsel tot kamertemperatuur afkoelen. Opmerking: Deze stap maakt het mogelijk de oligo te ontharden aan het einde van de λ-cDNA. Plaats het mengsel op het ijs. Voeg 11 µL van T4 DNA ligase reactie buffer (laatste buffer concentratie 1 x). Meng voorzichtig. Voeg vervolgens 2 µL (800 eenheden) van T4 DNA ligase enzym. Meng voorzichtig. Incubeer het mengsel gedurende 2 uur bij 16 ° C of ‘s nachts bij 4 ° C. Zuiveren het product centrifugaal filter buizen met een nominale moleculair gewicht limiet van 100 kDa. Specifiek, breng het mengsel stap 1.9 in een centrifugaal filter buis en centrifuge op 14.000 x g gedurende 5 minuten wassen met 400 µL TE buffer tweemaal en verzamelen van het gezuiverde product. Opmerking: De als-gezuiverd Biotine-λ-ANI in de buffer TE zijn stabiel op-20 ° C voor maximaal één jaar. 2. Dekglaasje aan functionalization Opmerking: glas coverslips zijn matiemaatschappij door te reageren met silane-PEG-biotine. Dit protocol one-step reactie is eenvoudiger en betrouwbaarder in onze ervaring dan de standaard twee stappen reactie protocol 20. Dekglaasje aan functionalization met silane-PEG-Biotine bandplaatsen voor daar maakt en niet-specifieke DNA en eiwit adsorptie aan het oppervlak van het dekglaasje aan minimaliseert. Sonicate vijf nummer 1 coverslips in ethanol van 95% binnen een kleuring jar gedurende 10 minuten en spoel na met ultrazuiver water voor driemaal. Opmerking: De vijfde dekglaasje aan biedt een reserve in geval van breuk. Vul de kleuring pot met 1 M KOH, bewerk ultrasone trillingen ten gedurende 10 minuten en spoel na met ultrazuiver water driemaal. De 2.1-2.2 cyclus tweemaal herhalen. Droog de coverslips onder de schone, droge N 2 gasstroom. Verder schoon en droog zijn de coverslips door het toepassen van plasma luchtbehandeling bij 900 mTorr druk gedurende 5 minuten Coverslips met 25 mg/mL silane-peg-biotine, opgelost in ethanol van 95% bij kamertemperatuur voor 2 h. specifiek Incubeer sandwich 50 µL siliciumwaterstof-peg-Biotine oplossing tussen twee schone, droge coverslips en Incubeer het dekglaasje aan " broodjes " in een gesloten Pipetteer tip doos met ongeveer 10 mL water aan de onderkant (niet in contact met de coverslips) te minimaliseren verdampend oplosmiddel. Wegwassen overtollige PEG moleculen met ultrazuiver water en droog de PEG coverslips onder schoon gecoat droog N 2 gasstroom. Opmerking: De functionalized coverslips kan worden opgeslagen tot drie dagen onder omgevingsomstandigheden. 3. Stromen van cel bouw Opmerking: Flow cellen worden geconstrueerd door een dubbel-plakband met voorgesneden kanalen tussen klemmen een PEG matiemaatschappij dekglaasje aan en een PDMS plaat met inlaat en uitlaat gaten. Meerdere kanalen zijn geïntegreerd per stroom cel. Stroom kanalen in een CAD-software ontwerp en knippen van de kanalen (de breedte, diepte en lengte van elke kanalen zijn 1, 0.13 en 12 mm, respectievelijk) op een dubbel-plakband met behulp van een cutter tape (doorgaans acht kanalen per stroom cel zijn geïntegreerd). Verwijderen van tape storingswaarden tot de kanalen van de stroom. Om PDMS platen, meng grondig 45 g PDMS met 5 g van het crosslinking reagens (genoeg voor het maken van twaalf 5 mm dikke PMDS platen die voor onbepaalde tijd kunnen worden opgeslagen onder omgevingsomstandigheden) met behulp van een mixer, giet het mengsel in twee petrischaaltjes van 10 cm, en laat de gerechten binnen een vacuuemcel totdat in wezen alle luchtbellen zijn verdwenen (handmatig verwijderen luchtbellen als om het even welk blijven wanneer de gerechten uit de Vacuuemcel zijn verwijderd). Breng de gerechten in een oven van 80 ° C, totdat PDMS stolt (ongeveer 2 h). Knip een PDMS plaat die overeenkomt met de grootte van de dubbel-plakband met voorgesneden kanalen. Peel een beschermfolie uit de double-plakband en houden de film naar een platte gezicht van de PDMS plak. Punch van de uitlaat en inlaat gaten op de plaat van de PDMS een biopsie-perforator met een naald Gauge 23. Schil van de tweede film van de bescherming van de dubbel-plakband en houden van de vergadering van de PDMS-tape op het functionalized oppervlak van het dekglaasje aan (zorg ervoor dat het dekglaasje aan plat is. Zie een afbeelding van een cel volledig geassembleerd stroom in Figuur 1a). 4. TIRF Imaging Opmerking: Biotine-λ-Ani zijn vastgebonden aan een stroom kanaal oppervlak en laminaire flow wordt toegepast op stroom rekken de DNA moleculen ( Figuur 1b). De > 80% uitgerekt DNA moleculen dienen als ruimtelijk uitgebreide sjablonen voor de observatie van de activiteit van het bindende en vervoer van fluorescently geëtiketteerde molecules. De trajecten van afzonderlijke moleculen worden bijgehouden door time-lapse TIRF imaging ( Figuur 1 c & e). Fix de cel in de stroom van een Microscoop fase en belasting vooraf ontgaste lege buffer (10 mM natriumfosfaat, 2 mM NaCl, 50 µM EDTA, 20 mM ethanol, 5% (v/v) glycerol, 0,01% Tween-20, 1% (v/v) β-mercaptoethanol, pH 7.4), 0,2 mg/mL daar oplossing, 1 mg / mL boviene serumalbumine (BSA) oplossing en 100 pM Biotine-λ-DNA oplossing in vier reservoirs dat elk hebben een Tygon buis op een magneetventiel waarde aangesloten en een ander Tygon buis op een buis PEEK aangesloten door de Tygon buis over de kleinere PEEK buis (sleeving Hiermee voorkomt u dat terugvoer van reagentia). Kleine hoeveelheid buffer ontgas door nachtelijke blootstelling aan vacuüm of kortere blootstelling aan vacuüm met roeren (tot bubbels niet langer zichtbaar zijn). Steek de buis PEEK van het reservoir leeg buffer in een inlaat-opening van de stroom-cel. Het kanaal door stroomt in lege buffer Prime en drie andere PEEK-tubing in inlaat gaten de luchtdruk gedreven stroom van elk reagens is gecontroleerd door magneetafsluiters en volledig geautomatiseerd via een computer script invoegen. Wees voorzichtig niet te induceren lucht luchtbel vorming in het kanaal. Sluit een Tygon buizen met een korte buis PEEK uit het gat van de uitlaat naar een afval container. De korte buis PEEK aan de uitlaat helpt lucht zeepbel formatie tijdens infusie onderdrukken door het behoud van de positieve druk in het kanaal. Tethering Biotine-λ-DNA moleculen op een stroom kanaal oppervlak. Flow in 0,2 mg/mL daar oplossing, Incubeer gedurende 5 min en dan stromen in lege buffer te wassen uit de niet-afhankelijke streptavidine. Stroom in 1 mg/mL BSA oplossing, Incubeer gedurende 1 min en vervolgens stromen in lege buffer voor het wassen van de niet-afhankelijke BSA. Opmerking: BSA verder onderdrukt DNA en monster adsorptie aan de oppervlakte. Stroom in 100 pM Biotine-λ-DNA oplossing, Incubeer gedurende 10 min en vervolgens stromen in lege buffer te wassen de ANI van de niet-afhankelijke. Opmerking: Nadat het DNA is gebonden aan het oppervlak, Vermijd snelle stromen om schade te voorkomen aan de vastgebonden DNA moleculen. Om te controleren de kwaliteit van de functionalized dekglaasje aan, stromen in DNA op kleuring kleurstof zoals Sytox oranje onder de voorwaarden van de test worden gebruikt (Lees 4.6 hieronder), en beginnen met fluorescentie onder 532 nm laser verlichting imaging. Opmerking: De kwaliteit van de functionalized dekglaasje aan is meestal goed en de dichtheid van stroom uitgerekt DNA moleculen zullen hoog. Het is absoluut noodzakelijk dat er een hoog genoeg dichtheid van stroom uitgerekt DNA moleculen zodat DNA bindende en glijden / 1D diffusie evenementen kunnen worden waargenomen. Fine tune de hoek van de TIRF om de beste signaal / ruisverhouding van beelden van gestrekte DNA moleculen ( Figuur 1 d). Om vast te leggen trajecten van afzonderlijke moleculen bewegen langs DNA, herhaal stap 4.2-4.4 binnen een nieuw kanaal (zonder DNA kleuring kleurstof), dan vooraf ontgaste sub-nanomolar fluorophore moleculen op een hoog genoeg stroomtarief aangeduid met behulp van een spuitpomp infusie en verzamelen van time-lapse fluorescentie beelden met een framerate van 100 Hz. Opmerking: Een debiet equivalent aan enkele Weissenberg (Wi: de dimensieloze product van het polymeer ontspanning langst – ongeveer 0,2 s voor λ-DNA- en de shear rate – de verandering van de stroomsnelheid met afstand het dekglaasje aan oppervlak) van 500 binnen de kanaal wordt aanbevolen voor enkel molecuul beeldbewerking met een framerate van 100 Hz 21. Verzamelen 10.000 frames in een veld-Of-View (FOV) om een film te produceren, en het verzamelen van soortgelijke films uit meerdere (meestal tien) FOVs per monster. Opmerking: De dichtheid van enkele deeltjes in een FOV moet niet te hoog – die data-analyse door het maken van object toewijzing in kaders dubbelzinnig, noch te laag – die tot lage plaatsvinden van één molecuul gebeurtenissen op DNA leiden kan zal compliceren. Optimaliseren de verlichting intensiteit zodat moleculen gebonden aan het dekglaasje aan oppervlak snel foto-gebleekt achtergrond onderdrukken terwijl verspreiden op DNA moleculen niet te snel gebleekt zijn dus dat langere trajecten kunnen worden gedetecteerd. Opmerking: We gebruiken meestal 200-800 W/cm 2 vermogensdichtheid in de FOV. Aan het einde van stap 4.6, Infundeer DNA kleurstof vlekken om te bevestigen dat DNA moleculen nog steeds stroom-uitgerekt kunnen. Lopen zowel positieve en negatieve controlemonsters. Opmerking: Een goede positieve controle is een tetrapeptide, TetraMethylRhodamine (TMR)-KRRR (TMR is gekoppeld aan de N-terminale amine) die heeft een gemiddelde constante van de verspreiding van de 1D van 10,5 ± 0,7 (standaardfout) M (bp 2/s) bij neutrale pH 11. Een goede negatieve controle is voor het meten van gelabelde monsters van belang in assay buffer in een kanaal dat geen DNA aangebonden, waar geen op-DNA diffusie-activiteit moet worden gedetecteerd heeft. 5. Gegevensanalyse: Opmerking: een aangepaste één deeltje tracking software wordt gebruikt voor het identificeren van de trajecten van afzonderlijke moleculen verspreiden langs DNA en schatten van diffusie-constanten zijn. Deze software bepaalt eerst de centroid posities van enkele deeltjes met een hoge nauwkeurigheid, identificeert deeltjes die op het dekglaasje aan oppervlak vastzitten, en dan links deeltjes in verschillende frames te vormen van time-lapse trajecten. Uit deze trajecten, de 1D-diffusie-constanten zijn geschatte. Om te beginnen van data-analyse, open een scripting software (zie tabel van materialen) en ga naar de directory van het één deeltje tracking software. Open het script met de naam " largedataprocess3.m ". Een belangrijke parameter in te stellen is de drempelwaarde voor de detectie van één deeltje. Om te bepalen van de optimale drempelwaarde, lopen de " Determine_threshold_value.m " script. Dit script zal aangeven hoe de drempelwaarde van invloed is op één deeltje detectie. Na het bepalen van de optimale drempelwaarde, lopen de " largedataprocess3.m " script. Na de voltooiing van één deeltje bijhouden van analyse, filteren de ruwe trajecten door het uitvoeren van de " Trajectory_filtering.m " script. Een grafische User Interface (GUI) is ingebouwd in de filterprocedure visualiseren. Op the GUI paneel, stelt u de minimale verplaatsing langs DNA, MinXDisp, op 2 pixels ingesteld de maximale verplaatsing dwars op DNA, MaxYDisp, 2 pixels; het minimale aantal frames, minFrames, ingesteld op 10; het minimale aantal staten triplet, minTriplets, ingesteld op 10; de constante minimale verspreiding langs DNA, D_par, ingesteld op 0; de constante maximale geschatte diffusie dwarse ingesteld op DNA, D_trans, tot 10 M (bp 2) S -1; de minimale statistiek parameter, Chi 2 _stat, ingesteld op -5; de minimale verhouding van verplaatsing langs DNA instelt dat dwarse aan DNA, MinX/Y, 2. Opmerking: Alle rauwe trajecten die passeren deze filteren parameters zijn vermeld in tabel 1, en die niet zijn vermeld in tabel 3. Klik op een traject nummer in tabel 1, het traject zal worden verplaatst in Graphics 1 & 2. Klik op de " Play " knop om te spelen de beelden van de ruwe fluorescentie. Klik op de " Add_to_Table2 " om te identificeren van het traject als een enkel molecuul glijden traject. Op het einde, alle trajecten toegevoegd aan tabel2 worden opgeslagen bij het afsluiten van de GUI. Voor het berekenen van de gemiddelde diffusie-constanten, voer het script " Calculate_mean_diffusion_constant.m ". De constante gemiddelde diffusie wordt geschat uit de reeks van de trajecten die heb geslaagd voor alle filteren stappen en toegevoegd aan tabel 2.