جزيء واحد بسيطة وقوية وعالية إنتاجية تدفق تمتد مقايسة التنفيذ لدراسة نقل جزيئات على طول الحمض النووي
Summary
ويبين هذا البروتوكول مقايسة تمتد تدفق جزيء واحد بسيطة وقوية وعالية إنتاجية لدراسة نشرها (1-د) أحادي الأبعاد للجزيئات على طول الحمض النووي.
Abstract
يصف لنا مقايسة تمتد تدفق جزيء واحد بسيطة وقوية وعالية إنتاجية لدراسة نشرها د 1 من الجزيئات على طول الحمض النووي. في هذا التحليل، هي فونكتيوناليزيد كوفيرسليبس الزجاج في رد فعل خطوة واحدة مع سيلاني-شماعة-البيوتين. تدفق الخلايا هي التي شيدت قبل ساندويتشينج شريط لاصق مع القنوات قبل قطع بين ساترة فونكتيوناليزيد ولوح PDMS التي تحتوي على فتحات مدخل ومخرج. قنوات متعددة تتكامل في خلية واحدة تدفق وتدفق المواد الكاشفة إلى كل قناة يمكن أن تكون مؤتمتة بالكامل، الذي إلى حد كبير يزيد الإنتاجية المقايسة ويقلل من الوقت للتدريب العملي على كل المقايسة. داخل كل قناة، البيوتين-λ-السلطات الوطنية المعينة هي معطلة على السطح ويتم تطبيق تدفق رقائقي تدفق تمتد السلطات الوطنية المعينة. وتستنفد جزيئات الحمض النووي > 80% من طول كفاف وتخدم مدد مكانياً قوالب لدراسة النشاط ملزمة والنقل من الجزيئات المسماة فلوريسسينتلي. يتم تعقب مسارات الجزيئات واحدة من الوقت الفاصل بين التصوير بمجموع الأسفار التأمل الداخلي (TIRF). ويتم تحليل صور raw استخدام مبسطة الجسيمات واحدة مخصصة تتبع البرامج لتحديد مسارات الجزيئات واحدة نشرها على طول الحمض النووي وتقدير تلك الثوابت نشرها د 1 تلقائياً.
Introduction
مشكلة طويلة الأمد في مجال البيولوجيا هو البروتينات الذاتية كيف أن يتصرف في محدد مواقع في الجينوم يمكن تحديد أهدافها الحمض النووي بسرعة كافية للكائنات الحية البقاء على قيد الحياة، والاستجابة بفعالية لبيئتها. اقترحت دراسات على مدى السنوات الأربعين الماضية، وسهلت إلى حد كبير دعم الفرضية القائلة بأن الحركية من الحمض النووي تستهدف البحث بروتين يمكن التعجيل بنشر فيه بدائل البروتين وبين نشر ثلاثية الأبعاد في معظم نشر د 1 (بما في ذلك انزلاق والتنقل بين العمليات) على طول الحمض النووي1. ومن المعروف الآن أن العديد من البروتينات المشاركة في تنظيم الجينات والحمض النووي الأيض والعمليات الأخرى قادرون على انزلاق على الحمض النووي2،3،،من45،6،7 ،،من89. وعلاوة على ذلك، أفادت الدراسات الحديثة أن الببتيدات الصغيرة حتى يمكن ربط والشرائح على الحمض النووي، مع القدرة على تحمل شحنة؛ على سبيل المثال، جزيء البروتين أو التمهيدي بكر، على طول الحمض النووي10،،من1112،،من1314.
على مدى السنوات ال 15 الماضية، مقايسة تمتد تدفق جزيء واحد يستخدم على نطاق واسع لدراسة الربط ونشرها للجزيئات على طول الحمض النووي2،،من1516. في هذا النوع من التحليل، هي المعطل تداولها جزيئات الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل بيوتينيلاتيد على السطح ويطبق تدفق رقائقي تدفق تمتد الحمض النووي. > 80% امتدت خدمة السلطات الوطنية المعينة كقوالب مكانياً الموسعة لدراسة النشاط ملزمة والنقل من الجزيئات المسماة مع fluorophores مسارات الجزيئات واحدة على طول الحمض النووي حيث يتم تعقبها بواسطة fluorescence الوقت الفاصل بين التصوير. في التنفيذ، الأمثل لسهولة الاستخدام، وإمكانية تكرار نتائج هذا التحليل يتكون من خمس خطوات رئيسية: إعداد البيوتين-λ-الحمض النووي، الروغان ساترة، وتدفق الخلية البناء وتصوير الأسفار وتحليل البيانات. في البروتوكولات السابقة17، كانت فونكتيوناليزيد كوفيرسليبس الزجاج بأول رد فعل مع (3-أمينوبروبيل) تريثوكسيسيلاني (أبتيس)، ومن ثم مع أمين المتفاعلة البولي إثيلين غليكول (شماعة) الكواشف (مثلاً، دائرة الصحة الوطنية–شماعة-البيوتين) تشكل طبقة ربط التي تقاوم غير محدد من الامتزاز مقايسة المكونات للسطح ساترة. نوعية كوفيرسليبس فونكتيوناليزيد إلى حد كبير يتوقف على نوعية شماعة الكواشف وشروط الرد في كل خطوة. ويصف لدينا بروتوكول بروتوكول الروغان مبسطة والتدفق متعدد الخلية البناء الذي يتطلب لا لاصق السائلة أو علاج الوقت على الخلايا تدفق اليوم يتم تجميعها. ونحن أيضا وصف بيانات مبسطة وقوية تحليل الداخلي11 أن يلغي خطوات الانحدار مكثفة حسابياً عن طريق تطبيق أسلوب تماثل شعاعي ل التعريب centroid18 و نشرها على أساس التباين المشترك مقيم دائم في19.
هنا، نحن تقارير بسيطة وقوية وعالية الإنتاجية جزيء واحد تدفق تمتد مقايسة التنفيذ مع تحسينات هامة في الروغان ساترة وتشييد الخلية تدفق وتحليل البيانات. على وجه الخصوص، قمنا بتطوير بروتوكول الروغان ساترة خطوة واحدة، التي كوفيرسليبس نظيفة جافة تتفاعل مباشرة مع سيلاني-شماعة-البيوتين. هذا البروتوكول يبسط إعداد ساترة، ويعمل على تحسين وثوقية نوعية الأسطح فونكتيوناليزيد مقارنة ببروتوكول رد فعل خطوتين القياسية. يصف لنا استخدام كوفيرسليبس فونكتيوناليزيد حتى مع الخلايا تدفق PDMS متعدد القنوات التي تتيح اتصالات أنابيب قوية دون الغراء. وتشمل هذه الخلايا تدفق مزيد متعددة الكمبيوتر التي تسيطر عليها مداخل لكل دائرة التدفق التي تتيح تدفق الكاشف الآلي لتقليل وقت التدريب العملي أثناء الإعداد والتحليل زيادة الإنتاجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
عند التبديل من خطوتين التقليدية ساترة الروغان رد الفعل بروتوكول إلى بروتوكول رد فعل خطوة واحدة، فقد لاحظنا أن موثوقية الروغان ساترة هو تحسن كبير. ما مجموع وقت التدريب العملي على إعداد ساترة أقل من ثلاثين دقيقة، نوصي بإعداد كوفيرسليبس جديدة تصوير جزيء واحد كل يوم ومن المعتزم. للحد من تدهور سيلاني-شماعة-البيوتين، ينبغي أن يكون الكاشف الكوتيد والمخزنة تحت ن2 الغاز الجاف في-20 درجة مئوية عند استلام. هنا نحن لا نستخدم شماعة الجزيئات التي تنتج-سجع– أو3 مجموعات المحطة الطرفية التي تم استخدامها في الماضي20-CH. واستخدمت الرسوم السلبية-سجع– الجماعات والمجموعات3 -CH مسعور لمنع الامتزاز غير محدد من جزيئات الحمض النووي والبروتين محددة عينات إلى السطح، على التوالي. نلاحظ الامتزاز السطحي منخفضا جداً بعينات الببتيد الصغيرة على السطح شماعة البيوتين منتهية بالكامل، بينما قد تكون مفيدة لفحوصات لبعض عينات البروتين سيلاني-شماعة-COOH و/أو سيلاني-شماعة-CH3 أو الاعتداء عندما الظروف (مثل درجة الحموضة < 7.5) تعزيز التفاعلات الحمض النووي من السطح.
التحول من الزجاج الشريحة تدفق الخلايا إلى تدفق PDMS الخلايا يسرع بناء خلية تدفق ويتيح التكامل السهل لقنوات متعددة. ونحن كثيرا ما مهندس ثماني قنوات كل خلية تدفق لتمكين ثماني تجارب مستقلة كل ساترة فونكتيوناليزيد. يمكن أن تستخدم لزيادة إنتاجية كل ساترة، إعداد أكبر من القنوات مايكرو ملفق.
فمن المستحسن لمنع تشكيل فقاعة هواء داخل القناة في أي نقطة بعد الملء الأولية. عادة، لا تسبب فقاعات الهواء خسارة المربوطة السلطات الوطنية المعينة (على الرغم من أن هذا أمر ممكن)، ولكن بدلاً من عرقلة تدفق وربما تسبب السلطات الوطنية المعينة على التمسك ساترة. المخزن المؤقت ولﻵﻻت وإضافة كميات صغيرة من السطح عادة فعالة في منع تشكيل فقاعة داخل الأنابيب وتدفق القناة. وفي الحالات التي أدخلت فيها فقاعات الهواء إلى الأنبوب، في محاولة لطرد الفقاعات تحت تدفق بطيء، والتأكد من أن أنها لا تتدفق من خلال المنطقة حيث يتم المربوطة السلطات الوطنية المعينة.
برنامج تحليل بيانات مبسطة وفعالة أمر بالغ الأهمية، نظراً لكمية ضخمة من البيانات التي تم إنشاؤها. عادة ما نجمع 700,000 الصور ذات الدقة العالية من قياسات تدفق واحد الخلية، التي يمكن معالجتها باستخدام لدينا الجسيمات واحدة مخصصة تتبع البرمجيات خلال يوم واحد على جهاز كمبيوتر سطح مكتب مع ذاكرة سعة 32 جيجابايت ومعالج رباعي. هو نموذج يعتمد معدل الإيجابية الكاذبة للكشف عن مسارات نشر د 1 من البرنامج (الخطوة 5، 5) ويمكن أن تكون منخفضة للغاية بالنظر إلى أن: 1) كثافة الجزيئات واحدة في فوف منخفضة بما يكفي حتى أن هناك القليل من الغموض ربط الجزيئات عبر الإطارات ( عينات البروتين بشكل عام أكثر عرضه الامتزاز غير محدد ساترة من عينات الببتيد، وهكذا، المخزن المؤقت وكثافة الطاقة لكل بروتين العينة يحتاج إلى أن يكون الأمثل)؛ 2) إشارة إلى نسبة الضوضاء من جزيئات مفردة عالية بما يكفي حتى يكون احتمال وقوع خطأ-تحديد جزيئات منخفضة. لا يزال، البرنامج يمكن أن يخطئ أحياناً، ونوصي بالتفتيش اليدوي للبيانات باستخدام واجهة المستخدم الرسومية المتوفرة لتقييم أداء البرامج. في أحد تطبيقات حساسة بشكل خاص للكشف عن مسار إيجابية كاذبة، عملية بما في ذلك قيمة العتبة، مينفراميس، مينتريبليتس، وتشي2_stat يمكن إعداد المعلمات أكثر صرامة على حساب أقل حساسية لربط صحيح الأحداث، ويحتمل أن تكون أكبر من التحيز الإحصائية في تحديد مسار. ونحن هنا مشاركة وتصف الجسيمات واحدة لدينا تتبع البرمجيات على أمل المساعدة في توحيد أساليب تحليل البيانات، وحفز النقاش حول أفضل الممارسات.
لدينا بروتوكول، الأمر الذي يتطلب استمرار تدفق أثناء التصوير للحفاظ على الدولة امتدت من جزيئات الحمض النووي قالب، يمكن أن التحيز تدفق السائل بنقل بعض البروتينات على طول قوالب الحمض النووي إذا كانوا منتشر بالتنقل إليه أو هيدرودينامية دائرة نصف قطرها فلوروفوري المسمى هو كبير22،23. في حين يمكن قياس مثل هذا التحيز وتصحيحها في معظم مجموعات البيانات، نقل البروتينات المسمى مع فلوروفوري صغيرة ونشرها باستخدام إليه انزلاق لا عادة متحيزة إلى حد لا يمكن اكتشافها بتدفق2،4، 24. جدير بالذكر أن تأثير سرعة تدفق على نقل البروتينات على طول الحمض النووي قد استخدمت لدراسة آليات البروتين نشرها على طول الحمض النووي23. أ عن كثب المتصلة بالنهج البديلة التي تمكن القياسات في الغياب تدفق تستخدم قوالب الحمض النووي مع البيوتين في كلا تيرميني عابر وتستنفد في تدفق والمربوطة بطرفي إلى ساترة مثل بقاء جزيئات الحمض النووي في التكوين الموسع عند إيقاف التدفق25،26،،من2728. نهج مزدوج-حبل في الاستفادة من السماح للتجارب الحرة تدفق النقل ولكن يتطلب تعديل طرفي من جزيئات الحمض النووي القالب، التحكم بالانسياب الدقيق أثناء الربط، وتميز المسافات بين موقعين المربوطة. وبالإضافة إلى ذلك، يجب تقييم أثر التوترات غير متجانسة وديناميات conformational الحمض النووي عبر جزيئات الحمض النووي في فحص جزيء واحد.
بالإجمال، بالإضافة إلى دراسة نشرها د 1 من الجزيئات على طول الحمض النووي، يمكن أن تستفيد الإنزيم جزيء واحد كما ذكرت كثيرة في المختبر الكيمياء الحيوية والدراسات الفيزيائية-الحيوية على مستوى جزيء واحد بما في ذلك الحمض النووي تستهدف عمليات البحث التي الأنشطة الانزيمية على الحمض النووي والبروتينات، وأكثر.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها
المشكلة 1: قنوات تدفق تسرب.
الحل: أولاً، تأكد من أن يسمح تصميم قنوات تدفق مالا يقل عن 1.5 مم الهامش لختم حولها وبين القنوات؛ ومن ثم، أثناء الجمعية العامة للخلية تدفق، تأكد من أن الاتصال السطوح بين ساترة والشريط اللاصق المزدوج ولوح PDMS مسطحة وجافة وخالية من الحطام، وأن الضغوط التي مورست لتشكيل الختم موحدة، وأن عملية التشميع المنجز في درجة حرارة الغرفة.
المشكلة 2: كثافة المعينة المربوطة منخفضة جداً.
الحل: هذه المشكلة تنشأ عندما كفاءة الروغان شماعة منخفض أو لا يتم فونكتيوناليزيد جزيئات الحمض النووي مع البيوتين. من خلال تجربتنا، ينبغي أن تكون كثافة الحمض النووي المربوطة مرتفعة بالنسبة > 90% كوفيرسليبس إعداد من الطازجة أو المخزنة بشكل صحيح كاشف سيلاني-شماعة-البيوتين. في الحالات عندما ينخفض كثافة الحمض النووي المربوطة بدفعه ثبت من البيوتين-λ-الحمض النووي، حاول زيادة تركيزات سيلاني-شماعة-البيوتين خلال شماعة الروغان وتركيزات streptavidin والبيوتين-λ-الحمض النووي أثناء الربط الحمض النووي. إذا فشل ذلك، استبدال الكواشف شماعة وستريبتافيدين.
مشكلة 3: السلطات الوطنية المعينة التمسك ساترةلا يمكن أن تمتد د بالتدفق.
الحل: يمكن أن تنشأ هذه المشكلة أيضا عند كفاءة الروغان شماعة منخفض، ويتفاقم بمقايسة انخفاض الأس الهيدروجيني. حاول تتدفق في أكثر جيش صرب البوسنة أو رفع درجة الحموضة (على سبيل المثال إلى 8.0) للمساعدة في قمع الدنا بالامتزاز على السطح (الخطوة 4.3.2). إذا كان الدنا بالامتزاز مشكلة مستمرة تحت شرط فحص خاصة، حاول بما في ذلك تصل إلى 90% سيلاني-شماعة-COOH خلال الروغان الوتد.
و يلاحظ من تحليل البيانات:
نحن نستخدم الجسيمات واحدة مخصصة تتبع البرامج لتحديد مسارات الجزيئات واحدة نشرها على طول الحمض النووي، ومن الذي يقدر على ثوابت نشر د 1، D1. من أجل تحسين تحليل البيانات، قمنا بتنفيذ خوارزمية التماثل شعاعي18 لإضفاء الطابع المحلي على الجسيمات و مقدر على أساس التباين19 د 1 نشر الثوابت، التي سرعت هائلا في تحليل البيانات دون المساس بتقدير دقة. سابقا يمكننا التحقق من صحة برامج مخصصة بتحليل بيانات المحاكاة11. فيما يلي الخطوات الرئيسية.
تحديد الجسيمات:
هذه الخطوة لكشف وتجزئة الجسيمات-البقع حيود محدودة-من الخلفية. أولاً، مكانياً الفرقة-تمرير تصفية الصور لتعزيز إشارات الجسيمات في 3-5 بكسل النطاق (والذي يتوافق مع حجم انتشار نقطة مهمة في نظامنا) ثم عتبة استناداً إلى كثافة (انظر البرنامج النصي: spt2_SD_sandbox.m).
تعيين centroid
تجزئة الصورة فقط يموضع الجزيئات على مستوى بكسل القرار المكانية. إلى ترجمة الجزيئات بكثير من الدقة أعلى، توظيف التماثل شعاعي القرار سوبر خوارزمية18 للصور التي تمت تصفيتها كما ذكر أعلاه. (هذا الأسلوب يستند حساب تحليلي وهكذا يقلل إلى حد كبير عبء الحسابية مقارنة مع أساليب أخرى عالية الدقة شعبية مثل تركيب غاوسي 2D (انظر البرنامج النصي: spt2_SD_sandbox.m).)
الجسيمات التي تتبع:
لتتبع مسار الجسيمات عبر الزمن، أننا يجب إعادة تعريف الجسيمات نفسها أنها تتحرك بين الإطارات. ونحن نعتبر مراحل بدء وتطرف، وإنهاء لتكون مكونات مسار. نحن تحد من الربط بين الجزيئات في الأطر الحالية لتلك التي تظهر في الإطارات السابقة بتشريد الحد الأقصى المسموح به لكل إطار. في الحالات التي تكون فيها الروابط متعددة ممكنة، يتم استخدام الخوارزمية جونكر-فولجينانت أن تسفر عن مجموعات الربط الأمثل على الصعيد العالمي (انظر البرنامج النصي: traceTraj4_kx.3.m).
تقدير D1:
لتقدير القيم D1 من المسارات، فإننا نستخدم مقدر على أساس التباين المشترك (CVE)19. يستند حساب تحليلي، هذا الأسلوب حسابياً أكثر كفاءة ودقيق إحصائيا أكثر من أخرى يشيع استخدام أساليب مثل انحدار تشريد التربيعية يعني (انظر البرنامج النصي: runspt5_SD.m).
مسار تصفية:
بعض المسارات تحتوي على القطع الأثرية مثل الارتباط بجزيئات السطح زمنياً ويجب إزالته. قمنا بتنفيذ العديد من الميزات مثل التشريد أدنى موازية للحمض النووي، والحد الأقصى التشرد عرضية للحمض النووي، والحد الأدنى من طول المسار، وأقل عدد ممكن من الثلاثي على التوالي الكشف عن المواقف، ودرجة احتمال الحد الأدنى (انظر شيونغ et al11 للتعريف) التي يمكن تصفيتها لعزل مجموعة الحد الأدنى متحيزة من المسارات المحتمل لتمثيل الجزيئات نشرها على الحمض النووي (انظر البرنامج النصي: sptViewFig2_update3x.m).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر توني كليسا وروبن كيركباتريك ايفانجيلوس جاتزوجيانيس للمساعدة في إعداد الأجهزة الأولية واختبار. ونشكر كذلك توني كوليسا لمساعدة هامة كتابة وتقييم الجسيمات واحدة مخصصة تتبع البرمجيات. هذا العمل كان يدعمها تمويل بدء التشغيل و “جائزة المهنة” في “الواجهة العلمية” (لثنائي الفينيل متعدد الكلور) من مؤسسة ويلكوم بوروز.
Materials
| Biotin labeled oligo, 5’-AGGTCGCCGCCC(A)20-biotin-3’ | IDT | Custom oligo synthesis | Standard desalting purification is sufficient |
| λ-DNA | New England Biolabs Inc. | N3011S | Make aliquots and minimize freeze-thaw cycle number |
| T4 DNA ligase and ligation reaction buffer | New England Biolabs Inc. | M0202S | |
| Amicon centrifugal filter tubes with NMWL of 100k Dalton | EMD Millipore | UFC510008 | |
| No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-106 | |
| Pure ethanol | VWR | 89125-186 | |
| Potassium hydroxide pellets | Fisher Scientific | P250-500 | |
| Plasma cleaner, model No. PDC-32G | Harrick Plasma | ||
| Silane-peg-biotin | Nanocs | PG2-BNSL-5k | Store at -20oC in dry nitrogen gas |
| A CAD software | Autodesk | AutoCAD | |
| Double-adhesive tape | Adhesive Applications | 8512-2-DP/DL | |
| Tape cutter, model No. CE5000-40-CRP | Graphtec America | ||
| PDMS and crosslink reagent kit | R.S. Hughes | RTV615 CLEAR 010 | |
| Degassing chamber, model No. F42010-0000 | BEL-ART Products | ||
| Mixer, model No. ARV-310 | Thinky | ||
| Hole puncher, Harris Uni-Cores, Size 0.5 mm | Harris Uni-Cores | This can be substituted with a manual biopsy punch with a similar needle size | |
| Tygon tubing | Cole Parmer | EW-06420-02 | 0.020" ID, 0.060"OD |
| Peek tubing | Western Analytical | PK007-031-Y | 0.007" ID, 0.031"OD |
| Streptavidin | New England Biolabs Inc. | N7021S | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs Inc. | B9000S | |
| Sytox orange nucleic acid stain | Invitrogen | S11368 | |
| Ti-E Microscope | Nikon | Microscope, camera, objective, dichroic mirror and bandpass filter can be substituted for similar equipment | |
| 100x Objective, NA/1.49, CFI Apo TIRF | Nikon | ||
| CMOS camera | Hammamatsu | Orca Flash 4.0 | |
| Dichroic mirror | Semrock | FF560/659-Di01-25×36 | |
| Bandpass filter | Semrock | FF560/659-Di01-25×36 | |
| 532 nm laser | Rayscience Innovation Limited, Shanghai | OEMLL-FN-532nm-C | Select wavelength to correspond to stain of choice |
| Syringe pump | Chemxy | Fusion 200 | |
| TMR-KRRR, >=85% purity | MIT Biopolymer lab | ||
| pVIc-Cy3B, HPLC purified | A gift from Dr. Walter Mangel at Brookhaven National lab | ||
| Script programming software | MathWorks | Matlab | |
| * see parts list for solenoid valves, computer interface, and assembly instructions at: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers |
References
- Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. 1. Models and theory. Biochemistry. 20, 6929-6948 (1981).
- Blainey, P. C., van Oijen, A. M., Banerjee, A., Verdine, G. L., Xie, X. S. A base-excision DNA-repair protein finds intrahelical lesion bases by fast sliding in contact with DNA. P Natl Acad Sci USA. 103, 5752-5757 (2006).
- Leith, J. S., et al. Sequence-dependent sliding kinetics of p53. P Natl Acad Sci USA. 109, 16552-16557 (2012).
- Blainey, P. C., et al. Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space IV. Viral proteinase slides along DNA to locate and process its substrates. J Biol Chem. 288, 2092-2102 (2013).
- Graziano, V., et al. Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space II. Adenovirus proteinase is activated in an unusual one-dimensional biochemical reaction. J Biol Chem. 288, 2068-2080 (2013).
- Graziano, V., et al. Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: I. binding to DNA and to hexon of the precursor to protein VI, pVI, of human adenovirus. J Biol Chem. 288, 2059-2067 (2013).
- Baniecki, M. L., McGrath, W. J., Mangel, W. F. Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: III. atomic resolution structure of the nascent form of the adenovirus proteinase. J Biol Chem. 288, 2081-2091 (2013).
- Kabata, H., et al. Visualization of single molecules of RNA polymerase sliding along DNA. Science. 262, 1561-1563 (1993).
- Harada, Y., et al. Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time. Biophysical journal. 76, 709-715 (1999).
- Mangel, W. F., McGrath, W. J., Xiong, K., Graziano, V., Blainey, P. C. "Molecular sled"- vehicle of 11-amino acids that facilitates biochemical interactions via sliding components along DNA. Nature Communications. , (2016).
- Xiong, K., Blainey, P. C. Molecular sled sequences are common in mammalian proteins. Nucleic Acids Res. 44, 2266-2273 (2016).
- Xiong, K., Erwin, G. S., Ansari, A. Z., Blainey, P. C. Sliding on DNA: from peptides to small molecules. Angew. Chem. Int. Ed. 55, 15110-15114 (2016).
- Turkin, A., et al. Speeding up biomolecular interactions by molecular sledding. Chem Sci. 7, 916-920 (2016).
- Zhang, L., Zheng, L., Meng, Z., Balinin, K., Loznik, M., Herrmann, ,. A. Accelerating chemical reactions by molecular sledding. Chem Commun (Camb). 47, 6331-6334 (2017).
- van Oijen, A. M., et al. Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder. Science. 301, 1235-1238 (2003).
- Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24, 10524-10531 (2008).
- Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., Oijen, A. M. V. Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay. J Vis. Expt. , e1689 (2010).
- Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nat Methods. 9, 724 (2012).
- Vestergaard, C. L., Blainey, P. C., Flyvbjerg, H. Optimal estimation of diffusion coefficients from single-particle trajectories. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 89, 022726 (2014).
- Schroeder, C. M., Blainey, P. C., Kim, S., Xie, X. S. . Hydrodynamic Flow-stretching Assay for Single-Molecule Studies of Nucleic Acid-Protein Interactions. , (2008).
- Blainey, P. C. . Single-Molecule Studies of Protein-DNA Interaction: Diffusive Search and Sequence-Dependent Motors. , (2007).
- Gorman, J., Greene, E. C. Visualizing one-dimensional diffusion of proteins along DNA. Nat Struct Mol Biol. 15, 768-774 (2008).
- Lin, Y. H., et al. Using the Bias from Flow to Elucidate Single DNA Repair Protein Sliding and Interactions with DNA. Biophysical journal. 96, 1911-1917 (2009).
- Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nat Struct Mol Biol. 16, 1224-1234 (2009).
- Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H., Schroeder, C. M. Direct observation of TALE protein dynamics reveals a two-state search mechanism. Nat Commun. 6, 7277 (2015).
- Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H. M., Schroeder, C. M. TALE proteins search DNA using a rotationally decoupled mechanism. Nat Chem Biol. 12, 831-837 (2016).
- Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57, 179-186 (2012).
- Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Method Enzymol. 472, 293-315 (2010).
