Burada, insan hücrelerinde Moloney fare lösemi virüsü tabanlı retroviral vektörlerin entegrasyon alanlarının genom çapında haritalanması için bir protokolü açıklıyoruz.
Moloney sıçangil lösemisi (MLV) virüs esaslı retroviral vektörler ağırlıklı olarak asetile arttırıcılar ve yükselticiler ile bütünleşir. Bu nedenle, mLV entegrasyon bölgeleri, aktif düzenleyici elementlerin işlevsel belirteçleri olarak kullanılabilir. Burada, hücreye özgü güçlendiricilerin ve yükselticilerin genom çapında tanımlanmasına olanak tanıyan bir retroviral tarama aleti sunuyoruz. Kısacası, hedef hücre popülasyonu, bir mLV türevi vektör ile transdüser hale getirilir ve genomik DNA sık sık kesme kısıtlama enzimi ile sindirilir. Genomik fragmanları uyumlu bir DNA bağlayıcısı ile bağladıktan sonra, linker aracılı polimeraz zincir reaksiyonu (LM-PCR), virüs konakçı genom kavşaklarının çoğaltılmasına izin verir. Genis çapında mLV entegrasyon profilini tanımlamak için amplikonların seri sıralaması kullanılır. Son olarak, tekrarlayan entegrasyon kümeleri, hücre tipine özgü transkripsiyonel programların aktivasyonundan sorumlu, hücreye özgü düzenleyici bölgelerin tanımlanması için tanımlanır.
<p class= "Jove_content"> Retroviral tarama aleti, prospektif olarak izole edilmiş hedef hücre popülasyonlarında hücreye özgü hızlandırıcıların ve arttırıcıların genom çapında tanımlanmasına izin verir. Özellikle, retroviral tarama, prospektif izolasyon için sağlam belirteçlerden yoksun nadir bulunan popülasyonların ( ör., Somatik kök hücreler) retrospektif olarak tanımlanması için bir enstrümantal tekniktir.Hücre kimliği, spesifik gen gruplarının ifadesi ile belirlenir. Organizmalar ve arttırıcılar gibi cis düzenleyici elemanların rolü, hücre tipi spesifik transkripsiyonel programların aktivasyonu için çok önemlidir. Bu düzenleyici bölgeler, çeşitli hücre tipleri 1 , 2 , 3'te genom geniş tanımlaması için yaygın olarak kullanılan özel histon modifikasyonları, transkripsiyon faktörleri ve ko-faktör bağlama ve kromatin erişilebilirliği gibi spesifik kromatin özellikleri ile karakterizedir. Özellikle, histone H3 lizin 27'nin (H3K27ac) asetillenmesinin genom çapındaki profili aktif promotörleri, arttırıcıları ve süper arttırıcıları 4 , 5 , 6 tanımlamak için yaygın olarak kullanılır.
Moloney fare lösemi virüsü (MLV) gen için yaygın olarak kullanılan bir gamma-retrovirüsüdürMemeli hücrelerinde transfer. Bir hedef hücrenin enfekte edilmesinden sonra, retroviral RNA genomu, ön entegrasyon kompleksini (PIC) birleştirmek için viral ve hücresel proteinleri bağlayan çift sarmallı bir DNA molekülüne retro-transkribe edilir. PIC çekirdeğe girer ve konakçı hücre kromatini bağlar. Burada, anahtar bir PIC bileşeni olan viral integraz, proviral DNA'nın konukçu hücre genomuna entegrasyonuna aracılık eder. Genomik DNA'daki mLV entegrasyonu rasgele değil, ancak promotör ve güç arttırıcılar gibi aktif cis düzenleyici elemanlarda, hücreye özel bir biçimde 7 , 8 , 9 , 10 meydana gelir. Bu özel entegrasyon profiline, mLV integraz ile hücresel bromodomain ve ekstraterminal alan (BET) proteinleri 11 , 12 , 13 arasındaki doğrudan etkileşim aracılık eder. BET proteinleri (BRD2, BRD3 veBRD4), konak kromatin ve mLV PIC arasında bir köprü görevi görürler: ekstratik alan, mLV integraz 11,12,13 ile etkileşirken, bromodomainsleri yoluyla yüksek oranda asetillenmiş cis düzenleyici bölgeleri tanımaktadırlar.
Burada, mLV'nin entegrasyon özelliklerine dayalı aktif cis düzenleyici bölgeleri haritalamak için yeni bir araç olan retroviral taramayı tarif ediyoruz. Kısaca hücreler, arttırılmış yeşil floresan protein (eGFP) raportör genini eksprese eden mLV türevi retroviral vektör ile transdüser hale getirilir. Genomik DNA özümlemesinden sonra, mLV vektörünün 3 'uzun terminal tekrarlaması (LTR) ile genomik DNA arasındaki bağlantı noktaları, bağlayıcı aracılı PCR (LM-PCR) ile çoğaltılmakta ve kitlesel sekanslanmaktadır. MLV entegrasyon bölgeleri insan genomuna eşlenir ve mLV tarafından yüksek oranda hedeflenen genomik bölgeler, mLV entegrasyon siteleri kümeleri olarak tanımlanır.
Retroviral taramaNing birçok insan primer hücrelerinde hücreye özgü aktif düzenleyici elementleri tanımlamak için kullanılmıştır 14,15. MLV kümeleri, çoğu H3K27ac gibi aktif histon işaretlerini barındıran ve hücreye spesifik olan, epigenetik olarak tanımlanmış yükselticiler ve eşlenik maddeler ile birlikte eşlendi. Retroviral tarama prospektif olarak saflaştırılmış hücre popülasyonlarında 7 , 14 yanı sıra prospektif izolasyon için etkili belirteçlerden yoksun olan keratinosit kök hücreleri gibi retrospektif olarak tanımlanmış hücre popülasyonlarında DNA düzenleyici elementlerin genom çapında belirlenmesini sağlar.
Burada, kromatin bölgelerini hedefleyen bir epigenetik olarak aktif promotörler ve arttırıcılar olarak işaretlenmiş bir retrovirüs olan mLV'nin entegrasyon sitelerinin genom çapında haritalandırılması için bir protokolü açıkladık. Protokolün kritik adımları ve / veya sınırlamaları şunları içerir: (i) hedef hücre popülasyonunun mLV iletim; (Ii) LM-PCR ile virüs-konakçı bağlantı noktalarının çoğaltılması; (Iii) entegrasyon alanlarının yüksek bir kısmının alınması. MLV ta…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Avrupa Araştırma Konseyi (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), İtalya Eğitim Bakanlığı, Üniversiteler ve Araştırma Bakanlığı'nın (Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro in Ricerca 2012-RBFR126B8I_003'teki FIRB-Futuro) hibeleriyle desteklendi , EPIGEN Epigenomik Flagship Projesi), İtalyan Sağlık Bakanlığı (Genç araştırmacılar Çağrı 2011 GR-2011-02352026) ve Imagine Enstitüsü Vakfı (Paris, Fransa).
PBS, pH 7.4 | ThermoScientific | 10010031 | or equivalent |
Fetal Bovine Serum | ThermoScientific | 16000044 | or equivalent |
0.2 ml tubes | general lab supplier | ||
1.5 ml tubes | general lab supplier | ||
QIAGEN QIAmp DNA mini Kit | QIAGEN | 51306 | or equivalent |
T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202T | |
T4 DNA Ligase Reaction buffer | New England BioLabs | M0202T | |
Linker Plus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
Linker Minus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
Tru9I | Roche-Sigma-Aldrich | 11464825001 | |
SuRE/Cut Buffer M | Roche-Sigma-Aldrich | 11417983001 | |
PstI | Roche-Sigma-Aldrich | 10798991001 | |
SuRE/Cut Buffer H | Roche-Sigma-Aldrich | 11417991001 | |
Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
10mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | or equivalent |
PCR grade water | general lab supplier | ||
96-well thermal cycler (with heated lid) | general lab supplier | ||
linker primer | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
MLV-3’ LTR primer | general lab supplier | 5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
linker nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
MLV-3’ LTR nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
linker nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
MLV-3’ LTR nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2 | general lab supplier | ||
Ethanol (absolute) for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | or equivalent |
Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector) | Invitrogen | K4500-01 | |
QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 28704 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | or equivalent |
Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | or equivalent |
100 bp DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | or equivalent |
6X Loading Buffer | ThermoScientific | R0611 | or equivalent |
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000 | |
Nextera XT Index kit | Illumina | FC-131-1001 or FC-131-1002 | |
2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix | KAPA Biosystems | KK2601 | |
Dynal magnetic stand for 2 ml tubes | Invitrogen | 12321D | or equivalent |
Agencourt AMPure XP 60 ml kit | Beckman Coulter Genomics | A63881 | |
Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 | general lab supplier | ||
Agilent 2200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2964AA | or equivalent |
D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | or equivalent |
D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | or equivalent |
KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism) | KAPA Biosystems | KK4835 | |
ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4329003 | |
NaOH 1.0 N, molecular biology-grade | general lab supplier | ||
HT1 (Hybridization Buffer) | Illumina | Provided in the MiSeq Reagent Kit | |
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles) | Illumina | MS-102-3001 | |
MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 | |
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 |