Ретровирусное сканирование: определение сайтов интеграции MLV для определения регуляторных областей, специфичных для клеток
Summary
Здесь мы опишем протокол для общего геномирования сайтов интеграции вирусных ретровирусных векторов мышиной лейкемии Moloney в клетках человека.
Abstract
Вирусные ретровирусные векторы вируса мышиной лейкемии Moloney (MLV) преимущественно интегрируются в ацетилированные энхансеры и промоторы. По этой причине сайты интеграции mlV могут использоваться как функциональные маркеры активных регуляторных элементов. Здесь мы представляем ретровирусный сканирующий инструмент, который позволяет идентифицировать клеточные энхансеры и промоторы по всему геному. Вкратце, популяция клеток-мишеней трансдуцирована вектором, полученным из mlV, и геномную ДНК расщепляют часто режущим ферментом рестрикции. После лигирования геномных фрагментов с совместимым ДНК-линкером, линкер-опосредованная полимеразная цепная реакция (LM-PCR) позволяет амплифицировать геномные соединения вирус-хозяин. Массивное секвенирование ампликонов используется для определения профиля интеграции mLV в геноме. Наконец, кластеры рекуррентной интеграции определены для идентификации специфичных к клеткам регуляторных областей, ответственных за активацию программ транскрипции, специфичных для клеточного типа.
<p class= "Jove_content"> Инструмент ретровирусного сканирования позволяет идентифицировать геномные промоторы и энхансеры, специфичные для клеток, в перспективно изолированных популяциях целевых клеток. Примечательно, что ретровирусное сканирование представляет собой инструментальный метод ретроспективной идентификации редких популяций ( например, соматических стволовых клеток), у которых отсутствуют надежные маркеры для предполагаемой изоляции.Introduction
Идентичность клетки определяется экспрессией определенных наборов генов. Роль цис-регуляторных элементов, таких как промоторы и энхансеры, имеет решающее значение для активации транскрипционных программ клеточного типа. Эти регуляторные области характеризуются специфическими хроматинными особенностями, такими как специфические модификации гистонов, факторы транскрипции и связывание кофакторов, а также доступность хроматина, которые широко используются для их идентификации по всему геному в нескольких типах клеток 1 , 2 , 3 . В частности, широкоформатный профиль ацетилирования гистона Н3-лизина 27 (H3K27ac) обычно используется для определения активных промоторов, энхансеров и суперусилителей 4 , 5 , 6 .
Вирус мышиной лейкемии Молони (MLV) является гамма-ретровирусом, который широко используется для генаПеренос в клетках млекопитающих. После заражения клетки-мишени ретровирусный РНК-геном ретро-транскрибируется в двухцепочечной молекуле ДНК, которая связывает вирусные и клеточные белки, чтобы собрать преинтегрирующий комплекс (PIC). ПИК входит в ядро и связывает хроматин клетки-хозяина. Здесь, вирусная интеграза, ключевой компонент ПОС, опосредует интеграцию провирусной ДНК в геном клетки-хозяина. Интеграция mLV в геномной ДНК не является случайной, но происходит в активных цис-регуляторных элементах, таких как промоторы и энхансеры, клеточно-специфическим способом 7 , 8 , 9 , 10 . Этот специфический профиль интеграции опосредуется прямым взаимодействием между mLV интегразой и клеточными бромдоменными и внетерминальными доменами (BET) белками 11 , 12 , 13 . BET белки (BRD2, BRD3 иBRD4) действуют как мостик между хроматином хозяина и mLV PIC: через их bromodomains они распознают высокоацетилированные цис-регуляторные области, в то время как внетерминальный домен взаимодействует с mLV интегразой 11 , 12 , 13 .
Здесь мы опишем ретровирусное сканирование, новый инструмент для отображения активных цис-регуляторных областей на основе интеграционных свойств mLV. Вкратце, клетки трансдуцированы с помощью полученного из MLV ретровирусного вектора, экспрессирующего репортерный ген усиленного зеленого флуоресцентного белка (eGFP). После экстракции геномной ДНК соединения между длинным 3'-концевым повтором (LTR) вектора mLV и геномной ДНК амплифицируют с помощью линкер-опосредованной ПЦР (LM-PCR) и последовательно секвенируют. Сайты интеграции mLV отображаются на геном человека, а геномные области с высокой концентрацией митохондрий определяются как кластеры сайтов интеграции mLV.
Ретровирусное сканированиеNing был использован для определения клеточных специфических активных регуляторных элементов в нескольких первичных клетках человека 14 , 15 . MlV кластеров, совместно отображаемых с эпигенетически определенными промоторами и энхансерами, большинство из которых содержат активные гистоновые метки, такие как H3K27ac, и являются клеточно-специфичными. Ретровирусное сканирование позволяет проводить идентификацию регуляторных элементов ДНК в проспективно очищенных клеточных популяциях 7 , 14 , а также в ретроспективно определенных клеточных популяциях, таких как стволовые клетки кератиноцитов, которые не обладают эффективными маркерами для предполагаемой изоляции 15 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описали протокол для геномного картирования сайтов интеграции mlV, ретровирус, который нацелен на участки хроматина, эпигенетически обозначенные как активные промоторы и энхансеры. Критические шаги и / или ограничения протокола включают в себя: (i) трансдукцию mlV популяции клет?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Европейского исследовательского совета (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), итальянского министерства образования, университетов и исследований (FIRB-Futuro в Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro в Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , Флагманский проект EPIGEN Epigenomics), Министерство здравоохранения Италии (Молодые исследователи Call 2011 GR-2011-02352026) и Фонд Imagine Institute (Париж, Франция).
Materials
| PBS, pH 7.4 | ThermoScientific | 10010031 | or equivalent |
| Fetal Bovine Serum | ThermoScientific | 16000044 | or equivalent |
| 0.2 ml tubes | general lab supplier | ||
| 1.5 ml tubes | general lab supplier | ||
| QIAGEN QIAmp DNA mini Kit | QIAGEN | 51306 | or equivalent |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202T | |
| T4 DNA Ligase Reaction buffer | New England BioLabs | M0202T | |
| Linker Plus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Linker Minus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Tru9I | Roche-Sigma-Aldrich | 11464825001 | |
| SuRE/Cut Buffer M | Roche-Sigma-Aldrich | 11417983001 | |
| PstI | Roche-Sigma-Aldrich | 10798991001 | |
| SuRE/Cut Buffer H | Roche-Sigma-Aldrich | 11417991001 | |
| Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| 10mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | or equivalent |
| PCR grade water | general lab supplier | ||
| 96-well thermal cycler (with heated lid) | general lab supplier | ||
| linker primer | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| MLV-3’ LTR primer | general lab supplier | 5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| linker nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| linker nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2 | general lab supplier | ||
| Ethanol (absolute) for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | or equivalent |
| Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector) | Invitrogen | K4500-01 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 28704 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | or equivalent |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | or equivalent |
| 100 bp DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | or equivalent |
| 6X Loading Buffer | ThermoScientific | R0611 | or equivalent |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000 | |
| Nextera XT Index kit | Illumina | FC-131-1001 or FC-131-1002 | |
| 2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Dynal magnetic stand for 2 ml tubes | Invitrogen | 12321D | or equivalent |
| Agencourt AMPure XP 60 ml kit | Beckman Coulter Genomics | A63881 | |
| Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 | general lab supplier | ||
| Agilent 2200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2964AA | or equivalent |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | or equivalent |
| D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | or equivalent |
| KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism) | KAPA Biosystems | KK4835 | |
| ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4329003 | |
| NaOH 1.0 N, molecular biology-grade | general lab supplier | ||
| HT1 (Hybridization Buffer) | Illumina | Provided in the MiSeq Reagent Kit | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles) | Illumina | MS-102-3001 | |
| MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 |
References
- Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
- Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).
- Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
- Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites identifies active regulatory elements in human multipotent hematopoietic progenitors. Blood. 116 (25), 5507-5517 (2010).
- Biasco, L., et al. Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell. EMBO Mol Med. 3 (2), 89-101 (2011).
- De Ravin, S. S., et al. Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration. J Virol. 88 (8), 4504-4513 (2014).
- LaFave, M. C., et al. mLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters. Nucleic Acids Res. 42 (7), 4257-4269 (2014).
- Gupta, S. S., et al. Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration. J Virol. 87 (23), 12721-12736 (2013).
- Sharma, A., et al. BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 12036-12041 (2013).
- De Rijck, J., et al. The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites. Cell reports. 5 (4), 886-894 (2013).
- Romano, O., et al. Transcriptional, epigenetic and retroviral signatures identify regulatory regions involved in hematopoietic lineage commitment. Sci Rep. 6, 24724 (2016).
- Cavazza, A., et al. Dynamic Transcriptional and Epigenetic Regulation of Human Epidermal Keratinocyte Differentiation. Stem Cell Reports. 6 (4), 618-632 (2016).
- Miller, A. D., Law, M. F., Verma, I. M. Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene. Mol Cell Biol. 5 (3), 431-437 (1985).
- Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites defines the fate of allogeneic T cells after donor lymphocyte infusion. PLoS One. 5 (12), e15688 (2010).
- Aiuti, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
- Biffi, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromatic leukodystrophy. Science. 341 (6148), 1233158 (2013).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Gillet, N. A., et al. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood. 117 (11), 3113-3122 (2011).
