Varredura Retroviral: Mapeamento de sites de integração MLV para definir regiões reguladoras específicas de células
Summary
Descrevemos aqui um protocolo para o mapeamento gen�ico dos s�ios de integra�o de vectores retrovirais baseados em v�us de leucemia murina de Moloney em c�ulas humanas.
Abstract
Os vectores retrovirais baseados em vírus da leucemia murina de Moloney (MLV) integram-se predominantemente em intensificadores e promotores acetilados. Por esta razão, os locais de integração mLV podem ser utilizados como marcadores funcionais de elementos reguladores activos. Aqui, apresentamos uma ferramenta de varredura retroviral, que permite a identificação genoma-wide de potenciadores e promotores específicos de células. Resumidamente, a população de células alvo é transduzida com um vector derivado de mLV e o ADN genómico é digerido com uma enzima de restrição de corte frequente. Após ligação dos fragmentos genómicos com um ligador de ADN compatível, a reacção em cadeia da polimerase mediada por ligante (LM-PCR) permite a amplificação das junções do genoma do vírus-hospedeiro. A sequenciação maciça dos amplicões é utilizada para definir o perfil de integração de mLV em todo o genoma. Finalmente, agrupamentos de integrações recorrentes são definidos para identificar as regiões reguladoras específicas de células, responsáveis pela ativação de programas de transcrição específicos de células.
<p class= "Jove_content"> A ferramenta de varredura retroviral permite a identificação genômica de promotores e intensificadores específicos de células em populações de células alvo prospectivamente isoladas. Notavelmente, a varredura retroviral representa uma técnica instrumental para a identificação retrospectiva de populações raras ( por exemplo , células estaminais somáticas) que não possuem marcadores robustos para isolamento prospectivo.Introduction
A identidade celular é determinada pela expressão de conjuntos específicos de genes. O papel dos elementos reguladores cis, tais como promotores e intensificadores, é crucial para a activação de programas de transcrição específicos do tipo celular. Estas regiões reguladoras são caracterizadas por características específicas da cromatina, tais como modificações peculiares das histonas, factores de transcrição e ligação dos co-factores e acessibilidade à cromatina, que têm sido amplamente utilizados para a sua identificação genómica em vários tipos de células 1 , 2 , 3 . Em particular, o perfil gen�ico de acetila�o da histona H3 lisina 27 (H3K27ac) � comummente utilizado para definir promotores activos, potenciadores e super-potenciadores 4 , 5 , 6 .
O vírus da leucemia murina de Moloney (MLV) é um gamma-retrovírus que é amplamente utilizado para o geneTransferência em células de mamíferos. Depois de infectar uma célula alvo, o genoma retroviral de ARN é retrotraducido numa molécula de ADN de cadeia dupla que se liga a proteínas virais e celulares para montar o complexo de pré-integração (PIC). O PIC entra no núcleo e liga a cromatina da célula hospedeira. Aqui, a integrase viral, um componente PIC chave, medeia a integração do ADN proviral no genoma da célula hospedeira. A integração de mLV no DNA genómico não é aleatória, mas ocorre em elementos reguladores cis-activos, tais como promotores e intensificadores, numa forma específica de célula 7 , 8 , 9 , 10 . Este perfil de integração peculiar é mediado por uma interacção directa entre a integrase de mLV e as proteínas do domínio do bromodominio celular e do domínio extraterminal (BET) 11 , 12 , 13 . As proteínas BET (BRD2, BRD3 eBRD4) atuam como uma ponte entre a cromatina do hospedeiro e o PIC mLV: através de seus bromodominios eles reconhecem regiões reguladoras cis altamente acetiladas, enquanto que o domínio extraterminal interage com a integrase mLV 11 , 12 , 13 .
Aqui, descrevemos a varredura retroviral, uma nova ferramenta para mapear regiões cis-reguladoras ativas com base nas propriedades de integração de mLV. Resumidamente, as células são transduzidas com o vector retroviral derivado de mLV que expressa o gene repórter de proteína fluorescente verde aumentada (eGFP). Após a extracção do ADN genómico, as junções entre a repetição terminal longa (LTR) 3 'do vector mlV e o ADN genómico são amplificadas por PCR (LM-PCR) mediada por ligantes e sequenciadas maciçamente. Os locais de integração de mLV são mapeados para o genoma humano e as regiões genómicas altamente direccionadas por mLV são definidas como agrupamentos de locais de integração de mLV.
Varredura retroviralNing foi usado para definir elementos específicos reguladores de células específicas em várias células primárias humanas 14,15. MLV co-mapeados com promotores epigenicamente definidos e potenciadores, a maioria dos quais abrigou marcas de histonas activas, tais como H3K27ac, e foram específicos de células. A varredura retroviral permite a identificação genômica de elementos reguladores do DNA em populações de células purificadas prospectivamente 7,14 , bem como em populações celulares retrospectivamente definidas, como as células-tronco de queratinócitos, que carecem de marcadores efetivos para o isolamento prospectivo 15 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos um protocolo para genoma de todo o mapeamento dos locais de integração de mLV, um retrovírus que metas regiões cromatina, epigenicamente marcado como promotores ativos e potenciadores. As etapas críticas e / ou limitações do protocolo incluem: (i) a transdução mLV da população de células alvo; (Ii) amplificação de junções vírus-hospedeiro por LM-PCR; (Iii) recuperação de uma fração elevada de locais de integração. Os vectores retrovirais baseados em mLV transduzem eficientemente …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por subvenções do Conselho Europeu de Investigação (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), do Ministério italiano da Educação, Universidades e Investigação (FIRB-Futuro em Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro em Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , EPIGEN Epigenomics Flagship Project), o Ministério Italiano da Saúde (Jovens Pesquisadores Chamam 2011 GR-2011-02352026) ea Imagine Institute Foundation (Paris, França).
Materials
| PBS, pH 7.4 | ThermoScientific | 10010031 | or equivalent |
| Fetal Bovine Serum | ThermoScientific | 16000044 | or equivalent |
| 0.2 ml tubes | general lab supplier | ||
| 1.5 ml tubes | general lab supplier | ||
| QIAGEN QIAmp DNA mini Kit | QIAGEN | 51306 | or equivalent |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202T | |
| T4 DNA Ligase Reaction buffer | New England BioLabs | M0202T | |
| Linker Plus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Linker Minus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Tru9I | Roche-Sigma-Aldrich | 11464825001 | |
| SuRE/Cut Buffer M | Roche-Sigma-Aldrich | 11417983001 | |
| PstI | Roche-Sigma-Aldrich | 10798991001 | |
| SuRE/Cut Buffer H | Roche-Sigma-Aldrich | 11417991001 | |
| Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| 10mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | or equivalent |
| PCR grade water | general lab supplier | ||
| 96-well thermal cycler (with heated lid) | general lab supplier | ||
| linker primer | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| MLV-3’ LTR primer | general lab supplier | 5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| linker nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| linker nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2 | general lab supplier | ||
| Ethanol (absolute) for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | or equivalent |
| Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector) | Invitrogen | K4500-01 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 28704 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | or equivalent |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | or equivalent |
| 100 bp DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | or equivalent |
| 6X Loading Buffer | ThermoScientific | R0611 | or equivalent |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000 | |
| Nextera XT Index kit | Illumina | FC-131-1001 or FC-131-1002 | |
| 2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Dynal magnetic stand for 2 ml tubes | Invitrogen | 12321D | or equivalent |
| Agencourt AMPure XP 60 ml kit | Beckman Coulter Genomics | A63881 | |
| Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 | general lab supplier | ||
| Agilent 2200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2964AA | or equivalent |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | or equivalent |
| D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | or equivalent |
| KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism) | KAPA Biosystems | KK4835 | |
| ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4329003 | |
| NaOH 1.0 N, molecular biology-grade | general lab supplier | ||
| HT1 (Hybridization Buffer) | Illumina | Provided in the MiSeq Reagent Kit | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles) | Illumina | MS-102-3001 | |
| MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 |
References
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