Retroviral סריקה: מיפוי MLV אתרי אינטגרציה להגדרת אזורים רגולטוריים ספציפיים לתא
Summary
כאן, אנו מתארים פרוטוקול המיפוי גנום רחב של אתרי אינטגרציה של מולוני Murine לוקמיה וירוס מבוססי וקטורים רטרוביראל בתאים אנושיים.
Abstract
Mukoney Murine לוקמיה (MLV) וירוס מבוססי וקטורים retroviral להשתלב בעיקר משפרי acetylated ויזמים. מסיבה זו, אתרי אינטגרציה mLV יכולים לשמש כסמנים פונקציונליים של רכיבים רגולטוריים פעילים. כאן, אנו מציגים כלי סריקה retroviral, אשר מאפשר זיהוי גנום רחב של משפרי תא ספציפי ומקדמים. בקצרה, האוכלוסייה היעד היעד transduced עם וקטור נגזר mLV ו DNA גנומי מתעכל עם אנזים הגבלת חיתוך לעתים קרובות. לאחר קשירת שברי הגנום עם מקשר DNA תואם, linker בתיווך פולימראז התגובה שרשרת (LM-PCR) מאפשר הגברה של צומת הגנום וירוסים המארח. רצף מסיבי של amplicons משמש כדי להגדיר את פרופיל האינטגרציה mLV גנום רחב. לבסוף, אשכולות של אינטגרציות חוזרות מוגדרים לזיהוי אזורים רגולטוריים ספציפיים לתא, האחראים להפעלת תוכניות תמלול ספציפיות מסוג תא.
<p class= "Jove_content"> כלי הסריקה retroviral מאפשר זיהוי גנום רחב של היזמים ספציפיים ספציפיות תא ב אוכלוסיות תאים היעד פרוספקטיבי. יש לציין, כי סריקה רטרו-ויראלית מייצגת טכניקה אינסטרומנטלית לזיהוי רטרוספקטיבי של אוכלוסיות נדירות ( כגון תאי גזע סומטיים) שאין להן סמנים חזקים לבידוד פוטנציאלי.Introduction
זהות התא נקבעת על ידי ביטוי של קבוצות ספציפיות של גנים. תפקידם של אלמנטים רגולטוריים של CIS, כגון יזמים ומשפרים, הוא קריטי להפעלת תוכניות תמליל ספציפיות מסוג תאים. אזורים רגולטוריים אלה מאופיינים בתכונות כרומטיות ספציפיות, כגון שינויים היסטוניים מוזרים, גורמי תעתיק ושיתוף גורמי שיתוף, וגישה לכרומטין, אשר שימשו באופן נרחב להגדרת הגנום שלהם במספר סוגי תאים 1 , 2 , 3 . בפרט, פרופיל הגנום רחב של אצטילציה של היסטון H3 ליזין 27 (H3K27ac) משמש בדרך כלל להגדיר היזמים פעיל, משפרי ומשפר סופר 4 , 5 , 6 .
Moloney Murine וירוס לוקמיה (MLV) הוא גמא רטרווירוס כי הוא בשימוש נרחב עבור הגןהעברה בתאי יונקים. לאחר הדבקה של תא מטרה, הגנום רטרובייראלי RNA הוא retro- transcribed במולקולה דנ"א כפול תקועים המחייבת חלבונים ויראליים וסלולריים להרכיב את מורכבות מראש אינטגרציה (PIC). PIC נכנס הגרעין וקושרת את הכרומטין התא המארח. כאן, אינטגרז ויראלי, מרכיב PIC מפתח, מתווך את האינטגרציה של ה- DNA פרובייר לתוך הגנום תא המארח. אינטגרציה של mLV בדנ"א הגנומי אינה אקראית, אלא מתרחשת במרכיבים פעילים של cis-regulation, כגון מקדמי ומשפר, בתא ספציפי 7 , 8 , 9 , 10 . פרופיל אינטגרציה מוזר זה מתווכת על ידי אינטראקציה ישירה בין אינטגרז mLV לבין חלבונים Bromodomain הסלולר ו extrerminal תחום (BET) חלבונים 11 , 12 , 13 . חלבונים BET (BRD2, BRD3, וBRD4) לשמש גשר בין הכרומטין המארח ל mLV PIC: דרך bromodomains שלהם הם מכירים מאוד cety- רגולציה אזורים, ואילו תחום extrerminal אינטראקציה עם אינטגרציה mLV 11 , 12 , 13 .
כאן, אנו מתארים את הסריקה רטרו-ויראלי, כלי חדש למפות אזורים פעילים cis- רגולציה מבוסס על תכונות שילוב של mLV. בקצרה, תאים transduced עם וקטור mLV הנגזר retroviral להביע את חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת (eGFP) גן הכתב. לאחר החילוץ הדנ"א הגנומי, הצמתים בין ה – LTR של ה – LTR של ה – LTR של וקטור ה – mLV לבין הדנ"א הגנומי מתוגברים על ידי PCR בתיווך מקושר (LM-PCR) ו רצף מאסיבי. אתרי אינטגרציה של mLV ממופים לגנום האנושי ולאזורים הגנומיים הממוקדים על ידי mLV מוגדרים כאשכולות של אתרי אינטגרציה mLV.
סריקת רטרו – ויראליNing שימש כדי להגדיר תא ספציפי אלמנטים רגולטוריים פעילים כמה תאים ראשוניים האנושי 14 , 15 . מקבצים mLV במשותף עם יזמים מוגדרים epigenetically ו משפרי, אשר רובם טמון סימני היסטון פעיל, כגון H3K27ac, היו ספציפיים תא. סריקה רטרו-ויראלית מאפשרת זיהוי גנום רחב של אלמנטים רגולטוריים של דנ"א באוכלוסיות תאים מטופלות פרוספקטיבית , 7 , 14 , כמו גם באוכלוסיות תאים מוגדרות רטרוספקטיבית, כגון תאי גזע קרטינוציטים, חסרים סמנים יעילים לבידוד פוטנציאלי 15 .
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, תיארנו פרוטוקול מיפוי רחב הגנום של אתרי אינטגרציה של mLV, רטרווירוס כי מטרות אזורי הכרומטין, מסומנים epigenetically כמו יזמים פעיל ומשפר. צעדים קריטיים ו / או מגבלות של הפרוטוקול כוללים: (i) התמרה mLV של אוכלוסיית תאים היעד; (Ii) הגברה של צומת המארח וירוס על ידי LM-PCR; (Iii) אחזור של…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של המועצה האירופית למחקר (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), משרד החינוך האיטלקי, אוניברסיטאות ומחקרים (FIRB-Futuro ב- Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro ב- Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , EPIGEN Epigenomics Flagship Project), משרד הבריאות האיטלקי (חוקרים צעירים קוראים 2011 GR-2011-02352026) ואת קרן מכון Imagine (פריז, צרפת).
Materials
| PBS, pH 7.4 | ThermoScientific | 10010031 | or equivalent |
| Fetal Bovine Serum | ThermoScientific | 16000044 | or equivalent |
| 0.2 ml tubes | general lab supplier | ||
| 1.5 ml tubes | general lab supplier | ||
| QIAGEN QIAmp DNA mini Kit | QIAGEN | 51306 | or equivalent |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202T | |
| T4 DNA Ligase Reaction buffer | New England BioLabs | M0202T | |
| Linker Plus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Linker Minus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Tru9I | Roche-Sigma-Aldrich | 11464825001 | |
| SuRE/Cut Buffer M | Roche-Sigma-Aldrich | 11417983001 | |
| PstI | Roche-Sigma-Aldrich | 10798991001 | |
| SuRE/Cut Buffer H | Roche-Sigma-Aldrich | 11417991001 | |
| Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| 10mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | or equivalent |
| PCR grade water | general lab supplier | ||
| 96-well thermal cycler (with heated lid) | general lab supplier | ||
| linker primer | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| MLV-3’ LTR primer | general lab supplier | 5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| linker nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| linker nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2 | general lab supplier | ||
| Ethanol (absolute) for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | or equivalent |
| Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector) | Invitrogen | K4500-01 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 28704 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | or equivalent |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | or equivalent |
| 100 bp DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | or equivalent |
| 6X Loading Buffer | ThermoScientific | R0611 | or equivalent |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000 | |
| Nextera XT Index kit | Illumina | FC-131-1001 or FC-131-1002 | |
| 2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Dynal magnetic stand for 2 ml tubes | Invitrogen | 12321D | or equivalent |
| Agencourt AMPure XP 60 ml kit | Beckman Coulter Genomics | A63881 | |
| Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 | general lab supplier | ||
| Agilent 2200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2964AA | or equivalent |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | or equivalent |
| D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | or equivalent |
| KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism) | KAPA Biosystems | KK4835 | |
| ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4329003 | |
| NaOH 1.0 N, molecular biology-grade | general lab supplier | ||
| HT1 (Hybridization Buffer) | Illumina | Provided in the MiSeq Reagent Kit | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles) | Illumina | MS-102-3001 | |
| MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 |
References
- Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
- Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).
- Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
- Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites identifies active regulatory elements in human multipotent hematopoietic progenitors. Blood. 116 (25), 5507-5517 (2010).
- Biasco, L., et al. Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell. EMBO Mol Med. 3 (2), 89-101 (2011).
- De Ravin, S. S., et al. Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration. J Virol. 88 (8), 4504-4513 (2014).
- LaFave, M. C., et al. mLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters. Nucleic Acids Res. 42 (7), 4257-4269 (2014).
- Gupta, S. S., et al. Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration. J Virol. 87 (23), 12721-12736 (2013).
- Sharma, A., et al. BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 12036-12041 (2013).
- De Rijck, J., et al. The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites. Cell reports. 5 (4), 886-894 (2013).
- Romano, O., et al. Transcriptional, epigenetic and retroviral signatures identify regulatory regions involved in hematopoietic lineage commitment. Sci Rep. 6, 24724 (2016).
- Cavazza, A., et al. Dynamic Transcriptional and Epigenetic Regulation of Human Epidermal Keratinocyte Differentiation. Stem Cell Reports. 6 (4), 618-632 (2016).
- Miller, A. D., Law, M. F., Verma, I. M. Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene. Mol Cell Biol. 5 (3), 431-437 (1985).
- Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites defines the fate of allogeneic T cells after donor lymphocyte infusion. PLoS One. 5 (12), e15688 (2010).
- Aiuti, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
- Biffi, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromatic leukodystrophy. Science. 341 (6148), 1233158 (2013).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Gillet, N. A., et al. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood. 117 (11), 3113-3122 (2011).
