Numérisation Retroviral: Mapping des sites d'intégration MLV pour définir des régions réglementaires spécifiques à une cellule
Summary
Nous décrivons ici un protocole pour la cartographie génomique des sites d'intégration des vecteurs rétroviraux à base de virus de la leucémie murine Moloney dans les cellules humaines.
Abstract
Les vecteurs rétroviraux à base de virus de la leucémie murine Moloney (MLV) s'intègrent principalement dans les agents améliorant et promoteurs acétylés. Pour cette raison, les sites d'intégration mLV peuvent être utilisés comme marqueurs fonctionnels des éléments réglementaires actifs. Ici, nous présentons un outil de balayage rétroviral, qui permet l'identification du génome des amplificateurs et des promoteurs spécifiques de cellules. En bref, la population de cellules cibles est transduit avec un vecteur dérivé de mLV et l'ADN génomique est digéré avec une enzyme de restriction souvent coupante. Après ligature de fragments génomiques avec un lieur d'ADN compatible, la réaction en chaîne par polymérase (LM-PCR) médiée par un lieur permet l'amplification des jonctions génome virus-hôte. Un séquençage massif des amplicons est utilisé pour définir le profil d'intégration de mLV en fonction du génome. Enfin, des grappes d'intégrations récurrentes sont définies pour identifier les régions réglementaires spécifiques aux cellules, responsables de l'activation des programmes de transcription spécifiques aux cellules.
<p class= "Jove_content"> L'outil de balayage rétroviral permet l'identification à l'échelle du génome de promoteurs et d'amplificateurs spécifiques de cellules dans des populations de cellules cibles prospectivement isolées. Notamment, le balayage rétroviral représente une technique instrumentale pour l'identification rétrospective de populations rares ( p. Ex. Cellules souches somatiques) qui manquent de marqueurs robustes pour l'isolement prospectif.Introduction
L'identité cellulaire est déterminée par l'expression d'ensembles spécifiques de gènes. Le rôle des éléments cis-régulateurs, tels que les promoteurs et les amplificateurs, est crucial pour l'activation de programmes de transcription spécifiques au type cellulaire. Ces régions réglementaires sont caractérisées par des caractéristiques spécifiques de la chromatine, telles que les modifications particulières des histones, les facteurs de transcription et la liaison des co-facteurs, et l'accessibilité à la chromatine, qui ont été largement utilisés pour leur identification à l'échelle du génome dans plusieurs types de cellules 1 , 2 , 3 . En particulier, le profil génomique de l'acétylation de l'histone H3 lysine 27 (H3K27ac) est couramment utilisé pour définir des promoteurs actifs, des amplificateurs et des super-amplificateurs 4 , 5 , 6 .
Le virus de la leucémie murine Moloney (MLV) est un retrovirus gamma largement utilisé pour le gèneTransfert dans des cellules de mammifères. Après avoir infecté une cellule cible, le génome d'ARN rétroviral est rétro-transcrit dans une molécule d'ADN double brin qui se lie aux protéines virales et cellulaires pour assembler le complexe de pré-intégration (PIC). La PIC entre dans le noyau et lie la chromatine de la cellule hôte. Ici, l'intégrase virale, un composant clé PIC, sert à faciliter l'intégration de l'ADN proviral dans le génome de la cellule hôte. L'intégration de mLV dans l'ADN génomique n'est pas aléatoire, mais se produit dans des éléments actifs régulateurs cis, tels que des promoteurs et des amplificateurs, de manière spécifique aux cellules 7 , 8 , 9 , 10 . Ce profil d'intégration particulier est médié par une interaction directe entre l'intégrase de mLV et les protéines de domaine de bromodomane cellulaire et de domaine extraterminal (BET) 11 , 12 , 13 . Les protéines BET (BRD2, BRD3 etBRD4) agissent comme un pont entre la chromatine de l'hôte et la PIC de mLV: à travers leurs bromodomains, ils reconnaissent des régions régulatrices cis cisées, fortement acceptées, tandis que le domaine extraterminal interagit avec l'intégrase de mLV 11 , 12 , 13 .
Ici, nous décrivons le balayage rétroviral, un nouvel outil pour mapper les régions actives cis-régulatrices en fonction des propriétés d'intégration de mLV. Brièvement, les cellules sont transduites avec un vecteur rétroviral dérivé de mLV exprimant le gène rapporteur de la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP). Après l'extraction de l'ADN génomique, les jonctions entre la répétition terminale de 3 '(LTR) du vecteur mLV et l'ADN génomique sont amplifiées par une PCR médiatisée (LM-PCR) et séquencées massivement. Les sites d'intégration mLV sont mappés au génome humain et les régions génomiques hautement ciblées par mLV sont définies comme des grappes de sites d'intégration mLV.
Analyse rétroviraleA été utilisé pour définir des éléments régulateurs actifs spécifiques de cellules dans plusieurs cellules primaires humaines 14 , 15 . Les grappes de mLV ont été co-mappées avec des promoteurs et des amplificateurs définis de manière épigénétique, dont la plupart abritaient des marques d'histones actives, telles que H3K27ac, et étaient spécifiques de cellules. Le balayage rétroviral permet l'identification à l'échelle du génome des éléments de régulation de l'ADN dans les populations de cellules prospectivement purifiées 7 , 14 ainsi que dans les populations de cellules rétrospectivement définies, telles que les cellules souches de kératinocytes, qui ne présentent pas de marqueurs efficaces pour l'isolement prospectif 15 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous avons décrit un protocole pour la cartographie génomique des sites d'intégration de mLV, un rétrovirus qui cible les régions de chromatine, marquées épigénétiquement en tant que promoteurs et amplificateurs actifs. Les étapes critiques et / ou les limitations du protocole comprennent: (i) la transduction de mLV de la population de cellules cibles; (Ii) l'amplification des jonctions virus-hôte par LM-PCR; (Iii) récupération d'une fraction élevée des sites d'intégration. Les vecte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions du Conseil européen de la recherche (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), du Ministère italien de l'éducation, des universités et de la recherche (FIRB-Futuro in Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro in Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , EPIGEN Epigenomics Flagship Project), le ministère italien de la Santé (Jeunes chercheurs appelle 2011 GR-2011-02352026) et la Fondation Imagine Institute (Paris, France).
Materials
| PBS, pH 7.4 | ThermoScientific | 10010031 | or equivalent |
| Fetal Bovine Serum | ThermoScientific | 16000044 | or equivalent |
| 0.2 ml tubes | general lab supplier | ||
| 1.5 ml tubes | general lab supplier | ||
| QIAGEN QIAmp DNA mini Kit | QIAGEN | 51306 | or equivalent |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202T | |
| T4 DNA Ligase Reaction buffer | New England BioLabs | M0202T | |
| Linker Plus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Linker Minus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Tru9I | Roche-Sigma-Aldrich | 11464825001 | |
| SuRE/Cut Buffer M | Roche-Sigma-Aldrich | 11417983001 | |
| PstI | Roche-Sigma-Aldrich | 10798991001 | |
| SuRE/Cut Buffer H | Roche-Sigma-Aldrich | 11417991001 | |
| Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| 10mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | or equivalent |
| PCR grade water | general lab supplier | ||
| 96-well thermal cycler (with heated lid) | general lab supplier | ||
| linker primer | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| MLV-3’ LTR primer | general lab supplier | 5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| linker nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| linker nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2 | general lab supplier | ||
| Ethanol (absolute) for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | or equivalent |
| Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector) | Invitrogen | K4500-01 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 28704 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | or equivalent |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | or equivalent |
| 100 bp DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | or equivalent |
| 6X Loading Buffer | ThermoScientific | R0611 | or equivalent |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000 | |
| Nextera XT Index kit | Illumina | FC-131-1001 or FC-131-1002 | |
| 2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Dynal magnetic stand for 2 ml tubes | Invitrogen | 12321D | or equivalent |
| Agencourt AMPure XP 60 ml kit | Beckman Coulter Genomics | A63881 | |
| Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 | general lab supplier | ||
| Agilent 2200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2964AA | or equivalent |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | or equivalent |
| D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | or equivalent |
| KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism) | KAPA Biosystems | KK4835 | |
| ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4329003 | |
| NaOH 1.0 N, molecular biology-grade | general lab supplier | ||
| HT1 (Hybridization Buffer) | Illumina | Provided in the MiSeq Reagent Kit | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles) | Illumina | MS-102-3001 | |
| MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 |
References
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