Retrovirale Scanning: Mapping MLV Integration Sites om de specifieke codespecifieke regio's te definiëren
Summary
Hier beschrijven we een protocol voor de genoom-brede mapping van de integratie-sites van Moloney-muizen-leukemie-virus-gebaseerde retrovirale vectoren in menselijke cellen.
Abstract
Moloney muizen leukemie (MLV) -virus gebaseerde retrovirale vectoren integreren overwegend in geacyleerde versterkers en promoters. Om deze reden kunnen mLV-integratieplaatsen worden gebruikt als functionele markers van actieve regulerende elementen. Hier presenteren wij een retrovirale scan tool, waarmee de genoom-breed identificatie van celspecifieke enhancers en promotors mogelijk is. In het kort wordt de doelcellenpopulatie getransduceerd met een mLV-afgeleide vector en genomisch DNA wordt verteerd met een frequent snijbeperkingsenzym. Na ligatie van genomische fragmenten met een compatibele DNA-linker maakt linker-gemedieerde polymerase kettingreactie (LM-PCR) de amplificatie van de virus-gastheer-genoomverbindingen mogelijk. Massieve sequentiebepaling van de ampliconen wordt gebruikt om het mLV integratieprofiel genoom breed te definiëren. Tenslotte worden clusters van terugkerende integraties gedefinieerd om celspecifieke regulerende gebieden te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de activatie van specifieke transcriptieprogramma's van de celtype.
<p class= "Jove_content"> Het retrovirale scaninstrument maakt de genoom-breed identificatie van celspecifieke promotors en enhancers mogelijk in prospectief geïsoleerde doelcelpopulaties. Met name retrovirale scanning is een instrumentale techniek voor de retrospectieve identificatie van zeldzame populaties ( bijv. Somatische stamcellen) die robuuste markers voor toekomstige isolatie hebben.Introduction
Celidentiteit wordt bepaald door de expressie van specifieke sets genen. De rol van cis-regulerende elementen, zoals promotors en enhancers, is van cruciaal belang voor de activatie van specifieke transcriptieprogramma's van de celtype. Deze regulerende gebieden worden gekenmerkt door specifieke chromatinfuncties, zoals eigenaardige histon-modificaties, transcriptiefactoren en co-factoren binding, en chromatin toegankelijkheid, die veel gebruikt zijn voor hun genoom-brede identificatie in verscheidene celtypes 1 , 2 , 3 . In het bijzonder wordt het genoom-breed profiel van acetylering van histon H3-lysine 27 (H3K27ac) algemeen gebruikt om actieve promoters, versterkers en superversterkers 4 , 5 , 6 te definiëren.
Moloney muizen leukemie virus (MLV) is een gamma-retrovirus dat algemeen gebruikt wordt voor genenOverdracht in zoogdiercellen. Na het infecteren van een doelcel, wordt het retrovirale RNA-genoom getranscribeerd in een dubbelstrengs DNA-molecuul dat virale en cellulaire eiwitten bindt om het pre-integratiecomplex (PIC) te assembleren. De PIC komt in de kern en bindt de gastheercelchromatine. Hier bemiddelt de virale integrase, een belangrijke PIC component, de integratie van het provirale DNA in het gastheer-genoom. MLV-integratie in het genomische DNA is niet willekeurig, maar komt in actieve cis-regulerende elementen, zoals promoters en versterkers, op een celspecifieke wijze 7 , 8 , 9 , 10 voor . Dit eigenaardige integratieprofiel wordt gemedieerd door een directe interactie tussen de mLV integrase en de cellulaire bromodomain en extraterminale domein (BET) eiwitten 11 , 12 , 13 . BET eiwitten (BRD2, BRD3 enBRD4) fungeren als een brug tussen gastheerchromatine en mLV PIC: door hun bromomaten herkennen zij sterk geacyleerde cis-regulerende gebieden, terwijl het extraterminale domein interactieert met de mLV integrase 11 , 12 , 13 .
Hier beschrijven we het retrovirale scannen, een nieuw gereedschap om actieve cis-regulerende gebieden te lokaliseren op basis van de integratie eigenschappen van mLV. In het kort worden cellen getransduceerd met mLV-afgeleide retrovirale vector die het verbeterde groene fluorescerende eiwit (eGFP) reportergen tot expressie brengt. Na de genomische DNA-extractie worden de kruisingen tussen de 3'-lange terminale herhaling (LTR) van de mlV-vector en het genomische DNA geamplificeerd door linker gemedieerde PCR (LM-PCR) en massief opeenvolgend. MLV-integratieplaatsen worden toegewezen aan het menselijk genoom en genomische gebieden die sterk gerangschikt zijn door mLV worden gedefinieerd als clusters van mLV-integratieplaatsen.
Retrovirale scanNing werd gebruikt om celspecifieke actieve regulerende elementen in verschillende menselijke primaire cellen 14 , 15 te definiëren. MLV clusters co-mapped met epigenetisch gedefinieerde promoters en enhancers, waarvan de meeste actieve histonenmerken, zoals H3K27ac, bevatten en cellspecifiek waren. Retrovirale scanning laat de genoombrede identificatie van DNA regulatorische elementen toe in prospectief gezuiverde celpopulaties 7 , 14 , evenals in retrospectief gedefinieerde celpopulaties, zoals keratinocytstamcellen, die geen effectieve markers voor toekomstige isolatie hebben 15 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier hebben we een protocol beschreven voor genoom-wide mapping van de integratie sites van mLV, een retrovirus dat zich richt op chromatinegebieden, epigenetisch gemarkeerd als actieve promotors en enhancers. Kritieke stappen en / of beperkingen van het protocol omvatten: (i) mLV transductie van de doelcellenpopulatie; (Ii) amplificatie van virus-gastheer kruisingen door LM-PCR; (Iii) het ophalen van een hoge fractie integratieplaatsen. MLV-gebaseerde retrovirale vectoren transduceren delende cellen efficiënt. De lage…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Europese Onderzoeksraad (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), het Italiaanse Ministerie van Onderwijs, Universiteiten en Onderzoek (FIRB-Futuro in Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro in Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , EPIGEN Epigenomics Flagship Project), het Italiaanse Ministerie van Volksgezondheid (Young Researchers Call 2011 GR-2011-02352026) en de Stichting Imagine Institute (Parijs, Frankrijk).
Materials
| PBS, pH 7.4 | ThermoScientific | 10010031 | or equivalent |
| Fetal Bovine Serum | ThermoScientific | 16000044 | or equivalent |
| 0.2 ml tubes | general lab supplier | ||
| 1.5 ml tubes | general lab supplier | ||
| QIAGEN QIAmp DNA mini Kit | QIAGEN | 51306 | or equivalent |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202T | |
| T4 DNA Ligase Reaction buffer | New England BioLabs | M0202T | |
| Linker Plus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Linker Minus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Tru9I | Roche-Sigma-Aldrich | 11464825001 | |
| SuRE/Cut Buffer M | Roche-Sigma-Aldrich | 11417983001 | |
| PstI | Roche-Sigma-Aldrich | 10798991001 | |
| SuRE/Cut Buffer H | Roche-Sigma-Aldrich | 11417991001 | |
| Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| 10mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | or equivalent |
| PCR grade water | general lab supplier | ||
| 96-well thermal cycler (with heated lid) | general lab supplier | ||
| linker primer | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| MLV-3’ LTR primer | general lab supplier | 5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| linker nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| linker nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2 | general lab supplier | ||
| Ethanol (absolute) for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | or equivalent |
| Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector) | Invitrogen | K4500-01 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 28704 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | or equivalent |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | or equivalent |
| 100 bp DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | or equivalent |
| 6X Loading Buffer | ThermoScientific | R0611 | or equivalent |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000 | |
| Nextera XT Index kit | Illumina | FC-131-1001 or FC-131-1002 | |
| 2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Dynal magnetic stand for 2 ml tubes | Invitrogen | 12321D | or equivalent |
| Agencourt AMPure XP 60 ml kit | Beckman Coulter Genomics | A63881 | |
| Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 | general lab supplier | ||
| Agilent 2200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2964AA | or equivalent |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | or equivalent |
| D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | or equivalent |
| KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism) | KAPA Biosystems | KK4835 | |
| ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4329003 | |
| NaOH 1.0 N, molecular biology-grade | general lab supplier | ||
| HT1 (Hybridization Buffer) | Illumina | Provided in the MiSeq Reagent Kit | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles) | Illumina | MS-102-3001 | |
| MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 |
References
- Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
- Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).
- Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
- Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites identifies active regulatory elements in human multipotent hematopoietic progenitors. Blood. 116 (25), 5507-5517 (2010).
- Biasco, L., et al. Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell. EMBO Mol Med. 3 (2), 89-101 (2011).
- De Ravin, S. S., et al. Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration. J Virol. 88 (8), 4504-4513 (2014).
- LaFave, M. C., et al. mLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters. Nucleic Acids Res. 42 (7), 4257-4269 (2014).
- Gupta, S. S., et al. Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration. J Virol. 87 (23), 12721-12736 (2013).
- Sharma, A., et al. BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 12036-12041 (2013).
- De Rijck, J., et al. The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites. Cell reports. 5 (4), 886-894 (2013).
- Romano, O., et al. Transcriptional, epigenetic and retroviral signatures identify regulatory regions involved in hematopoietic lineage commitment. Sci Rep. 6, 24724 (2016).
- Cavazza, A., et al. Dynamic Transcriptional and Epigenetic Regulation of Human Epidermal Keratinocyte Differentiation. Stem Cell Reports. 6 (4), 618-632 (2016).
- Miller, A. D., Law, M. F., Verma, I. M. Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene. Mol Cell Biol. 5 (3), 431-437 (1985).
- Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites defines the fate of allogeneic T cells after donor lymphocyte infusion. PLoS One. 5 (12), e15688 (2010).
- Aiuti, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
- Biffi, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromatic leukodystrophy. Science. 341 (6148), 1233158 (2013).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Gillet, N. A., et al. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood. 117 (11), 3113-3122 (2011).
