ريتروفيرال المسح الضوئي: تعيين مواقع تكامل ملف لتحديد المناطق التنظيمية الخاصة بالخلية
Summary
هنا، نحن تصف بروتوكول لرسم الخرائط على نطاق الجينوم من مواقع التكامل من مولوني الفئران فيروس اللوكيميا النواقل الفيروسية القائمة على فيروس في الخلايا البشرية.
Abstract
مولوني الفئران اللوكيميا (ملف) الفيروسات الفيروسية القائمة على الفيروس تتكامل في الغالب في المحسنات أسيتيلاتد والمروجين. لهذا السبب، يمكن استخدام مواقع التكامل مف كعلامات وظيفية من العناصر التنظيمية النشطة. هنا، نقدم أداة مسح الفيروسات الرجعية، والذي يسمح لتحديد الجينوم على نطاق واسع من المعززات خلية محددة والمروجين. باختصار، يتم ترانزدوسد السكان الخلية المستهدفة مع ناقلات المشتقة ملف ويتم هضم الحمض النووي الجيني مع انزيم تقييد القطع في كثير من الأحيان. بعد ربط الشظايا الجينومية مع رابط الحمض النووي متوافق، وتفاعل سلسلة البلمرة ربط بوساطة (لم-ير) يسمح التضخيم من تقاطع الجينوم الفيروس المضيف. ويستخدم تسلسل هائل من أمبليكونس لتحديد ملف التكامل التكامل الجينوم واسعة. وأخيرا، يتم تعريف مجموعات من التكامل المتكررة لتحديد المناطق التنظيمية محددة الخلية، المسؤولة عن تفعيل الخلايا من نوع برامج النسخي محددة.
<p class= "jove_content"> تسمح أداة المسح الضوئي للفيروسات الرجعية بتحديد الجينوم على نطاق واسع للمروجين والمحسنات الخاصة بالخلية في مجموعات الخلايا المستهدفة معزولة مستقبلا. ومن الجدير بالذكر أن المسح الضوئي للفيروسات الرجعية يمثل تقنية فعالة للتعرف بأثر رجعي على السكان النادرين ( مثل الخلايا الجذعية الجسدية) التي تفتقر إلى علامات قوية للعزلة المرتقبة.Introduction
يتم تحديد هوية الخلية عن طريق التعبير عن مجموعات محددة من الجينات. دور العناصر التنظيمية سيس، مثل المروجين والمعززة، أمر بالغ الأهمية لتفعيل الخلايا من نوع برامج النسخي محددة. وتتميز هذه المناطق التنظيمية بميزات لونين محددة، مثل تعديلات هيستون غريبة، وعوامل النسخ والعوامل المشتركة الملزمة، وإمكانية الوصول إلى الكروماتين، والتي استخدمت على نطاق واسع لتحديدها على نطاق الجينوم في عدة أنواع من الخلايا 1 ، 2 ، 3 . على وجه الخصوص، يستخدم على نطاق واسع الجينوم على نطاق واسع من أستيليون هيستون H3 ليسين 27 (H3K27ac) لتحديد المروجين النشطة، والمحسنات وعظم المعززات 4 ، 5 ، 6 .
مولوني الفئران فيروس سرطان الدم (مف) هو فيروس غاما ريتروفيروس الذي يستخدم على نطاق واسع للجيناتنقل في خلايا الثدييات. بعد إصابة الخلية المستهدفة، يتم إعادة نسخ جينوم الحمض النووي الريبي ريتروفيرال في جزيء الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل الذي يربط البروتينات الفيروسية والخلوية لتجميع مجمع ما قبل التكامل (بيك). بيك يدخل نواة ويربط لونين الخلية المضيفة. هنا، إنتغراس الفيروسية، عنصر بيك الرئيسية، يتوسط دمج الحمض النووي بروفيرال في الجينوم الخلية المضيفة. والتكامل ملف في الحمض النووي الجيني ليس عشوائيا، ولكن يحدث في العناصر النشطة التنظيمية سيس، مثل المروجين والمعززين، بطريقة محددة خلية 7 ، 8 ، 9 ، 10 . يتم التوسط هذا الملف التكامل غريبة عن طريق التفاعل المباشر بين إنتغراس مف والبرومودومين الخلوية والنطاق إكستراترمينال (بيت) البروتينات 11 ، 12 ، 13 . البروتينات بيت (BRD2، BRD3، وBRD4) بمثابة جسر بين الكروماتين المضيف و بيك الموافقة المسبقة عن علم: من خلال برومودومينز أنها تعترف للغاية أسيتيلاتد المناطق التنظيمية رابطة الدول المستقلة، في حين أن المجال إكستراترمينال يتفاعل مع مف إنتغراس 11 ، 12 ، 13 .
هنا، نحن تصف المسح الضوئي للفيروسات الرجعية، أداة جديدة لتعيين المناطق النشط- سيس التنظيمية على أساس خصائص التكامل من مف. باختصار، يتم ترانسدوسد الخلايا مع ناقلات فيروس النسخ الاحتياطي المستمدة مف لفب التعبير عن تعزيز البروتين الأخضر الفلورسنت (إغف) مراسل الجينات. بعد استخراج الحمض النووي الجيني، يتم تضخيم تقاطعات بين 3 'تكرار محطة طويلة (لتر) من ناقلات مف والحمض النووي الجيني من قبل ربط بوساطة ير (لم-ير) وتسلسل بشكل واسع. يتم تعيين مواقع التكامل ملف إلى الجينوم البشري والمناطق الجينومية المستهدفة للغاية من قبل ملف تعرف بأنها مجموعات من مواقع التكامل ملف.
المسح الضوئي للفيروسات الرجعيةتم استخدام نينغ لتحديد العناصر التنظيمية النشطة الخلية محددة في العديد من الخلايا الأولية الإنسان 14 ، 15 . مف التي تم تحديدها بشكل مشترك مع المروجين والمعززين المعرفة إبيجينيتيكالي، ومعظمها تأوي علامات هيستون النشطة، مثل H3K27ac، وكانت محددة الخلية. المسح الضوئي للفيروسات الرجعية يسمح لتحديد الجينوم على نطاق واسع من العناصر التنظيمية الحمض النووي في مستقبلي تنقيته السكان الخلية 7 ، 14 ، وكذلك في السكان خلية محددة بأثر رجعي، مثل الخلايا الجذعية الخلايا الكيراتينية، التي تفتقر إلى علامات فعالة لعزلة المحتملين 15 .
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، وصفنا بروتوكول لرسم الخرائط على نطاق الجينوم على مواقع التكامل من مف، وهو فيروس ريتروفيروس الذي يستهدف مناطق الكروماتين، علامة إبيجينيتيكالي كما المروجين النشطة والمحسنات. الخطوات الحاسمة و / أو القيود على البروتوكول ما يلي: (ط) تنبيغ مف السكان الخلية المستهدف?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل بمنح مقدمة من مجلس البحوث الأوروبي (إرك-2010-أدغ، غ-سكين)، ووزارة التعليم الإيطالية والجامعات والبحوث (فيرب-فوتورو في ريسركا 2010-RBFR10OS4G، فيرب-فوتورو في ريسركا 2012-RBFR126B8I_003 ، ومشروع إبيجن إبيجينوميكس الرائد)، ووزارة الصحة الإيطالية (باحثون شباب دعوة 2011 غر-2011-02352026) ومؤسسة معهد إيماجين (باريس، فرنسا).
Materials
| PBS, pH 7.4 | ThermoScientific | 10010031 | or equivalent |
| Fetal Bovine Serum | ThermoScientific | 16000044 | or equivalent |
| 0.2 ml tubes | general lab supplier | ||
| 1.5 ml tubes | general lab supplier | ||
| QIAGEN QIAmp DNA mini Kit | QIAGEN | 51306 | or equivalent |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202T | |
| T4 DNA Ligase Reaction buffer | New England BioLabs | M0202T | |
| Linker Plus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Linker Minus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Tru9I | Roche-Sigma-Aldrich | 11464825001 | |
| SuRE/Cut Buffer M | Roche-Sigma-Aldrich | 11417983001 | |
| PstI | Roche-Sigma-Aldrich | 10798991001 | |
| SuRE/Cut Buffer H | Roche-Sigma-Aldrich | 11417991001 | |
| Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| 10mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | or equivalent |
| PCR grade water | general lab supplier | ||
| 96-well thermal cycler (with heated lid) | general lab supplier | ||
| linker primer | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| MLV-3’ LTR primer | general lab supplier | 5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| linker nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| linker nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2 | general lab supplier | ||
| Ethanol (absolute) for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | or equivalent |
| Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector) | Invitrogen | K4500-01 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 28704 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | or equivalent |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | or equivalent |
| 100 bp DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | or equivalent |
| 6X Loading Buffer | ThermoScientific | R0611 | or equivalent |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000 | |
| Nextera XT Index kit | Illumina | FC-131-1001 or FC-131-1002 | |
| 2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Dynal magnetic stand for 2 ml tubes | Invitrogen | 12321D | or equivalent |
| Agencourt AMPure XP 60 ml kit | Beckman Coulter Genomics | A63881 | |
| Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 | general lab supplier | ||
| Agilent 2200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2964AA | or equivalent |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | or equivalent |
| D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | or equivalent |
| KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism) | KAPA Biosystems | KK4835 | |
| ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4329003 | |
| NaOH 1.0 N, molecular biology-grade | general lab supplier | ||
| HT1 (Hybridization Buffer) | Illumina | Provided in the MiSeq Reagent Kit | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles) | Illumina | MS-102-3001 | |
| MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 |
References
- Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
- Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).
- Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
- Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites identifies active regulatory elements in human multipotent hematopoietic progenitors. Blood. 116 (25), 5507-5517 (2010).
- Biasco, L., et al. Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell. EMBO Mol Med. 3 (2), 89-101 (2011).
- De Ravin, S. S., et al. Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration. J Virol. 88 (8), 4504-4513 (2014).
- LaFave, M. C., et al. mLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters. Nucleic Acids Res. 42 (7), 4257-4269 (2014).
- Gupta, S. S., et al. Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration. J Virol. 87 (23), 12721-12736 (2013).
- Sharma, A., et al. BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 12036-12041 (2013).
- De Rijck, J., et al. The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites. Cell reports. 5 (4), 886-894 (2013).
- Romano, O., et al. Transcriptional, epigenetic and retroviral signatures identify regulatory regions involved in hematopoietic lineage commitment. Sci Rep. 6, 24724 (2016).
- Cavazza, A., et al. Dynamic Transcriptional and Epigenetic Regulation of Human Epidermal Keratinocyte Differentiation. Stem Cell Reports. 6 (4), 618-632 (2016).
- Miller, A. D., Law, M. F., Verma, I. M. Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene. Mol Cell Biol. 5 (3), 431-437 (1985).
- Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites defines the fate of allogeneic T cells after donor lymphocyte infusion. PLoS One. 5 (12), e15688 (2010).
- Aiuti, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
- Biffi, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromatic leukodystrophy. Science. 341 (6148), 1233158 (2013).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Gillet, N. A., et al. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood. 117 (11), 3113-3122 (2011).
