マウスにおけるヒト化骨髄微小環境のバイオエンジニアリングとライブイメージングによるそれらの可視化

すべての動物実験は、英国内務省によって承認され、Cancer Research UKのガイドラインに従ってPPL 70/8904で実施された。ヒト臍帯血（UCB）および原発性ヒト急性骨髄性白血病（AML）サンプルの使用は、同意を得た後、イーストロンドン倫理委員会によって承認され、ヘルシンキ宣言に従って実施された。 1.ヒト造血細胞および間質細胞を有するバイオエンジニアリングコラーゲンベースの足場注記：プロトコール全体は無菌状態で、無菌物質で実施する必要があります。細胞培養培地1は、hMSC培地（MEM-α、P / Sおよび10％hMSC-FBS）に対応する。細胞培養液2は、EC培地（M199,20％FBS、P / S、10mM HEPES、50μg/ mLヘパリン、2mMグルタミン、50μg/ mL ECGS）に相当し、細胞培養液3は造血細胞培地およびP / S）。 臍帯血を準備するフィコール-パック密度勾配を用いて細胞（CB-のMNC）または一次AML（骨髄又は末梢血のMNC）ononuclear、十分に確立されたプロトコル53に記載の方法。 AMLの場合、OKT.3抗体を用いてT細胞を枯渇させる。 PBSで細胞を洗浄する前に、1×10 6 AML MNCあたり4μgのOKT.3を室温で30分間インキュベートする。必要であれば、2×10 8細胞/ mLで10％DMSOを含むFBS中のMNCを凍結保存する。 hMSC（培養培地1）およびEC（培養培地2）細胞培養物を調製する。 hMSC培地中の通常の細胞培養フラスコ上のプレートhMSC細胞（ 材料の表参照）。 EC培地中のコラーゲン1被覆表面のプレートEC（ 材料の表を参照）。 85〜90％の細胞コンフルエンスで、培地を除去し、PBSで2回洗浄し、トリプシン-EDTA溶液（1cm 2あたり20μL）を加える。 5分後、細胞が分離されていることを確認する。 1：1に希釈して細胞を回収する。3を細胞培養培地で処理する。 300×gで5分間遠心分離し、各細胞型について対応する培地に再懸濁し、Neubauerチャンバーを用いて細胞を計数する。 ミリリットルあたり10 7細胞- 2×10 6の細胞を使用します。両方の細胞タイプを一緒に使用する必要がある場合は、hMSCとECの懸濁液を1：1の比率で混合してください。 細胞懸濁液をインスリン注射器に移す。 メスを使用して、滅菌ゼラチンスポンジ（ 例えば、ゲルフォーム）初期足場（20mm×60mm×7mm）を同様のサイズ（6.6mm×7.5mm×7mm; 図1AおよびB ）の24個に切断する。 PBS（5分間）に浸漬してゼラチン足場を再構成する。 1つずつ、足場を滅菌組織に静かに置き、余分なPBSを除去する。 24ウェルプレート（超低取付面）の1つのウェルに足場を移し、10個の5を含む50μL注入するために注射器を使用し- 10 6細胞（hMSCの文献を1つまたはhECと組み合わせて; 図1C ）。 すべての必要な足場に間質細胞が播種されるまで、各足場でステップ1.7を繰り返す。 細胞培養インキュベーター（37℃およびCO 2 5％）の中で1時間インキュベートする。 各ウェルを3mLの細胞培養培地1（ 図1D ）で満たし、一晩のインキュベーションのために足場を細胞培養インキュベーター（37℃およびCO 2 5％）に戻す。 ECが足場に使用されている場合は、細胞培養培地2を使用してください。 CB-MNCを解凍し、適切なCD34 +セクションキットプロトコールに従ってCD34 +細胞を単離する。選択したCD34 +細胞を培地3に懸濁し、Neubauerチャンバーで計数する。 注：ここでは、細胞はmLあたり2×10 6細胞の濃度で使用した。 AML患者由来の一次試料を使用する場合、細胞を解凍し、FBS中で1:10に希釈し、300で5分間遠心分離するPBS-2％FBSに細胞を再懸濁し、抗ヒトCD3抗体（10 6細胞あたり2〜4μg）を添加し、室温で30分間インキュベートする。サイトカイン（20ng / mL顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、20ng / mL IL-3および20ng / mLトロンボポエチン（TPO））を補充した造血細胞培地に再懸濁し、300xgで5分間遠心分離する。 。 上記のように、ステップ1.7〜1.9を繰り返すが、この場合には間質成分の代わりにヒト造血細胞1×10 5個を播種する。 3mLの細胞培養培地3（ 図1D ）でウェルを満たし、一晩のインキュベーションのために足場を細胞培養インキュベーター（37℃およびCO 2 5％）に戻す。 ECが足場に使用されている場合、細胞培養培地2と3の1：1混合物を使用する。 組換えヒト骨形成タンパク質-2（rhBMP-2）担体骨格のみについて、足場を滅菌組織上に1つずつ静かに置き、過剰のPを除去するBS。足場をU底、96 穴プレート（ 図1E ）の1つのウェルに移し、足場を完全に覆うrhBMP-25μLを加える。 20μLのトロンビン、20μLのフィブリノーゲンを添加し、毎回足場を完全に覆うようにする（ 図1F ）。すべての必要な足場が処理されるまで各足場に対して手順を繰り返し、37℃で5〜10分間インキュベートする。凝固がうまく形成されているかどうかを確認する。 生物工学的足場の外科的移植注：ここでは、6〜12週齢のNSGマウスの雄または雌いずれかを使用した。動物は免疫不全であるので、全ての処置は無菌状態で行うべきである。ステップ2.10〜2.13は、生存戦略および術後ケアに関連する。 手術前60〜120分に、鎮痛剤（carprofen、5mg / kg体重/マウス）を皮下投与する。 0.5％のイソフルランおよび2L /分のO 2を有するチャンバー内で麻酔を誘導する。処置中にマウスを連続的にモニターすべきである。背中に容易にアクセスできるように、動物を腹臥位で手術領域に移す。 1.5％のイソフルランと2L /分のO 2を供給するノーズコーンを用いて動物を麻酔下に保つ。手術中にマウスを麻酔下に置いて、頻繁に動物の状態をチェックする。 麻酔下ではマウスの眼に眼科用ゲルを使用して乾燥を防ぎ、マウスを37℃に保ちます。 電動トリマーを使用して、マウスの後部に手術領域を剃る。皮膚を滅菌するには、希釈したクロレキシジン（PBSで1:10に希釈）に綿棒を浸し、この先端部を使用して皮膚表面をきれいにします。この手順を2回繰り返します。 滅菌鉗子とメス（またはハサミ）を使用して、皮膚の0.5〜0.7cm前後の完全な切開を行います。挿入された鉗子を使用する皮下組織の下にポケットを作る。 足場を皮下に挿入し、それがポケット内に深く配置されていることを確認します（ 図1GおよびH ）。手術用接着剤で切開部を閉鎖する（ 図1IおよびJ ）。 手術後の痛みを治療するために、ブプレノルフィン（0.1mg / kg体重）を皮下投与する。 回復中、動物をその側に予め温めたケージに入れ、正常な挙動が観察されるまで回復をモニターする。 鎮痛薬を水（carprofen、0.1 mg / mL水）で希釈し、手術後4日間飲料水として動物に与える。 48時間の術後の期間中、可能性のある副作用について動物および傷を頻繁に点検する。 3.マウストリートメント、安楽死、およびイメージングのためのサンプル検索注：スキャフォールドの分析は、移植後8週および24週。 画像化の60分前に、移植したマウスを37℃の加熱ボックスに入れて温め、非特異的部位をブロックするために100μLのヒト免疫グロブリンを静脈内投与する。 画像化の30分前に、目的の細胞を標識するために10μg（1マウスあたり）の特異的抗体を静脈内投与する。 イメージングの5分前に、血管構造を可視化するために、655nmフルオロフォア標識した血管プール剤（655-VPA）15μL（100μLのPBSで希釈）を静脈内投与する。 頚椎脱臼を介してマウスを安楽死させる。 シャープハサミを使用して、元の移植部位の近くで、マウスの背中に長手方向の皮膚切開を行う。 ピンセットとはさみの助けを借りて、足場が埋め込まれている皮下ポケットから皮膚を慎重に分離します。 ピンセットで足場を保持し、残った膜を切断して皮膚から静かに外植片aはさみを使用して足場を取り囲む組織。 図2に回収される足場の例を参照してください。 イメージングプレート（35mm×10mmペトリ皿）に速効性接着剤で足場を固定し、室温で生理食塩水（PBS）で満たします。 BMP足場の場合、プレートをPBSで満たす前に、外科用マイクロドリルを使用して、顕微手術顕微鏡下で骨表面を薄くする。これにより、フルオロフォアの可視化および高解像度の画像キャプチャが可能になる。足場の大きさに応じて、1.2または1.6 mmのバリを使用してください。 注：ユーザーは、骨の厚さに応じてドリルする量を認識します。一般に、BMP骨格が血管新生すると、骨は色がわずかに変化し、造影のための正確な厚さに近づくとより赤くなる。 プレートを共焦点顕微鏡のステージに挿入する。 4. 2光子マイクロスコープを用いたライブイメージングオピー注記：非デセンドディテクタ（NDD）を使用する場合は、必ずNDDスライダを使用して蛍光をNDDに向けるイメージングを行ってください。顕微鏡の構成を図3に示します。 顕微鏡とコンピュータの電源を入れ、 "Start System"をクリックしてソフトウェアを起動し、 "Acquisition"モードにします。 [手動ツールを表示する]チェックボックスをオンにします。 「レーザー」メニューでは、2光子レーザーを「オン」にして、ウォームアップして安定させます。 "Imaging Setup"メニューで、 "Channel Mode"と "Switch every frame"を同時にアクティブにします。 "Light Path"メニューで、 "Non Descanned"と "Main Beam Splitter MBS 760+"を選択します。 図4に示すように、4つのNDDを有効にして構成を設定します。 注：この構成では、骨構造からのコラーゲンシグナル（秒SHG）は、380〜485nm、FITC-hCD31 +ヒト内皮細胞およびAF488-hCD45 +ヒト造血細胞（500〜550nm）および655-VPA（640〜690nm）に集められる。 "Channels"メニューで、 "laser wavelength"を890 nmに設定し、パワーを50％に設定します。 「ゲイン（マスター）」を500〜600に、「デジタルオフセット」を0に、「デジタルゲイン」を各チャンネルごとに15に設定します。取得が開始されたら、これらの値を調整します。 「取得モード」では、組織に損傷を与えたり蛍光体を漂白したりすることなく、高解像度の画像を得るために必要なパラメータを設定します。 「スキャンモード」を「フレーム」、「フレームサイズ」を「x512 y512」、「ラインステップ」を1、「スピード」を9、「平均回数」を8、「ビット深度」を「8ビット」、 「モード」を「行」に、「方向」を「双方向」に、「方法」を「平均」に設定します。 「Zo」を設定する画像の最初のスキャンでは「om」を1に設定し、特定の領域に焦点を合わせる必要がある場合はそれを増やします。 足場を含むプレートを20X、1.0NA水浸レンズの下の顕微鏡ステージ上に置き、レンズが生理食塩水に触れるまで下げます。光源としてランプを使用して、顕微鏡の接眼レンズを使用して足場にレンズの焦点を設定します。 "Zスタック"メニューをアクティブにし、 "ファースト/ラスト"機能を選択し、2つのサブシーケンシャルスライス（ 例えば、 2μmZスタック）の間に必要な間隔を設定します。間隔をZスタック内で一定に保つ。 "ライブ"を選択すると、サンプルのライブスキャンをイメージし、最適な露出を得るために "デジタルゲイン"と "デジタルオフセット"を調整します。複数のチャンネルを同時に視覚化するには、「分割」機能を選択します。 「ステージ」メニューでは、「ライブ」モードで画像をスキャンし、ヒト造血細胞および脈管構造の位置などの、幹細胞移植（est）（ROI）。サンプルのスキャンが完了したら、最初のROIに移動してイメージングを開始します。 「ライブ」モードでは、「最初に設定する」および「最後に設定する」機能を使用して、関心領域を囲む3D Zスタックの上端および下端を設定します。終了したら、センター「C」を設定します。 「実験開始」ボタンを使用してROIの取得を開始します。 図4 、 図5 、および図6の画像の例を参照してください。 取得が完了したら、指定したフォルダに画像を保存します。次のROIに移動し、手順4.10を繰り返します。実験が完了したら、イメージングプレートを顕微鏡から取り出し、サンプルをプレートから慎重に取り外し、残っている糊をすべてきれいにします。 次の分析技術のためにサンプルを準備する。 サンプル処理g：組織学および免疫染色注：サンプルは、サンプルの固定、埋め込み、およびセクショニングのプロセスを記述するJoVE一般的な実験技術54に記載されているプロトコルに従って処理されます。骨形成サンプルは、固定プロセスと埋め込みプロセスとの間でEDTAベースの脱灰剤で7日間処理しなければならない。ブロッキング/透過化溶液は、1％Triton X-100、1％ウシ血清アルブミン（BSA）、および10％正常ヤギ血清（NGS）を含む10mM PBS pH7.4緩衝液である。 スライスをキシレンに10分間入れる）、キシレンで5分間、100％エタノールで5分間、70％エタノールで5分間、50％エタノールで5分間、H 2 Oで5分間。 スライスをクエン酸塩ベースの抗原を作用させない溶液に移す。 スライスを15分間煮沸し、室温まで冷ます。 1％Triton X-100（5分、3回）を含む10 mM PBS pH 7.4溶液でスライスを洗浄する。 サムを転送するブロッキング/透過化溶液に加え、30分間インキュベートする。 ブロッキング/透過化溶液で希釈した一次抗体を添加し、4℃で一晩インキュベートする。 1％Triton X-100（5分、3回）を含む10 mM PBS pH 7.4溶液でスライスを洗浄する。 ブロッキング/透過化溶液で希釈した二次抗体を室温で暗所で1時間添加する。 H 2 O（5分、3回）で洗浄する。 バックグラウンド蛍光を減少させるために、スライスをスーダンブラック作業溶液に10分間、暗所および室温で浸漬する。 スライスをH 2 O（5分、3回）で洗浄する。 DAPI（0.5μg/ mL）を含む蛍光性マウント培地を用いてスライスをマウントする。 スライスを4°Cで保存し、蛍光イメージングを行う前に、マウンティング培地が乾燥していることを確認します。 図7の画像例を参照してください。