JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

הנדסת ביו-הנדסה של Microenvironments מוח העצם של עכבר ויזואליזציה שלהם על ידי הדמיה חיה

Published: August 01, 2017
doi:
10.3791/55914
, , , ,
1Haematopoietic Stem Cell Laboratory,The Francis Crick Institute

Summary

שיטה ליצור ולחיות תמונות שונים מוח העצמות נישות בעכברים מוצג. בהתבסס על נישה תומכת שנוצרו על ידי תאים mesenchymal האדם, תוספת של תאים אנדותל האדם גורם להיווצרות של כלי אדם, ואילו תוספת של rhBMP-2 גורם להיווצרות של רקמת העצם של המוח האנושי.

Abstract

תאי גזע ההמטופויטים (HSCs) מתגוררים בגומחה של מח עצם (BM), רשת מורכבת ומורכבת של רכיבים המרכיבים ציטוקינים, גורמי גדילה ומטריצה ​​חוץ-תאית. היכולת של HSCs להישאר שקטים, לחדש את עצמם או להבדיל, ולרכוש מוטציות ולהפוך ממאיר תלוי אינטראקציות מורכבות שהם מקימים עם רכיבים סטרומה שונים. כדי לבחון את crosstalk בין HSCs האדם ואת גומחה BM האדם בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים, עיצבנו פרוטוקול מודל ectopically ותמונה גומחה BM האנושית בעכברים immunodeficient. אנו מראים כי השימוש של רכיבים סלולריים שונים מאפשר להיווצרות מבנים אנושיים הזדמנות לקיים engraftment hematopoietic לטווח ארוך האדם. באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים, אנו יכולים לחיות את התמונה מבנים אלה באתרו ברזולוציה תא יחיד, מתן כלי חדש עוצמה עבור אפיון פונקציונלי של האדם BMIcroenvironment ותפקידה בוויסות hematopoiesis נורמלי וממאיר.

Introduction

החלטות גורל תאים שנצפו תאי תא גזע מוסדרים בחוזקה על ידי גורמים פנימיים חיצוניים. בפרט, עכשיו הוא זיהה נרחב כי microenvironment BM משחק תפקיד בסיסי בשליטה על הבורר ב- HSCs מן שקט אל מדינה פעילה, כמו גם שלהם התחדשות עצמית או הבדל ההחלטה גורל 1 . יתר על כן, הממצאים האחרונים מראים כי ממאירות המטולוגיות משפיעות על תפקוד המיקרו-סביבה של BM, ומצביעות על קיומו של crosstalk פעיל בין שני תאים 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . למרות ההתקדמות האחרונות, שאלות מפתח רבות נותרו על האופן שבו פעילותם של מרכיבי BM-Niche ספציפיים תורמת להתנהגות HSC ולטרנספורמציה ממאירה.

Microenvironment BM הוא הטרוג מאוד תערובת קנאית ומורכבת של סוגי תאים שונים, כל אחד עם פונקציות מיוחדות. האנדותל השופע (EC) ורכיב כלי הדם מסדירים מחזור חומרים תזונתיים ומטבוליטים, החדירה והמעבר של תאים שונים ל- BM וממנו, וכמה פונקציות HSC 7 , 8 . תאים ממאנצ'ימלים סטרומלים (MSC), אוכלוסייה הטרוגנית של תאי גזע לא מובחנים ואבות שבוצעו באמצעות שלוש שושלות שונות ( כלומר, אוסטאוגני, chondrogenic, adipogenic), הם מרכיב בסיסי נוסף של נישה BM. אלה MSCs להתמקם הן באזורים מרכזיים של BM ו בקרבה לאזור endosteal. הם עשויים להיות קשורים עם מבנים וסקולריים והם מעורבים הרגולציה של הפונקציה HSC 9 , 10 , 11 , 12 , 13 ,"> 14 , 15 .

דיווחים רבים מציעים כי HSCs מתגוררים באתרים מוגדרים שונים בתוך המוח, וכי תפקידם עשוי להיות תלוי לוקליזציה המדויק שלהם. רוב הידע הנוכחי לגבי HSCs ואת האינטראקציה שלהם עם microenvironment BM נובע ממחקרים Murine 1 . השימוש מודלים xenograft הרחיב את הידע הזה כדי HSCs נורמלי וממאיר אדם, engrafting בתוך BM Murine של עכברים immunodeficient 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . למרות שזה מייצג מודל חוקי, הוא עדיין מציג אתגרים רבים, כגון הצורך התנאי העכבר הנמען ברוב המקרים כדי לאפשר הומאניות HSC האנושי engraftment או מחסום בין המינים והשפעתו הבינו היטב על אינטראקציות התא התא פונקציות.

השימוש בנטרול נוגדנים ועכברים מהונדסים גנטית, יחד עם xenotransplantation, היה אינסטרומנטלי להדגיש את הדיאלוג המורכב כי HSCs האדם להקים עם microenvironments שלהם. ההקדמה והתפתחות של מיקרוסקופיה intravital two-photon confocal יש עבר מחקרים אלה צעד קדימה, המאפשר ישיר, ברזולוציה גבוהה, דימות דינמי של מוח העצם 19 , 20 , 21 , 22 ומספק כלי רב עוצמה עבור תפקודית אפיון של microenvironment BM ותפקידה בוויסות פונקציה HSC. על מנת לעקוף חלק מהבעיות המתעוררות במודלים קסנו-טרנסלנטליים קלאסיים, המושג הנדסה מבנה BM אנושי הובא לידי ביטוי. מיזוג בין biomaterials ו מושתל תא מושגים, דוחות הראו את הכדאיות של מחקה את עצם האדםחץ מיקרו-סביבה באזורים ההטרוטופיים 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . זה פותח את האפשרות של שימוש bioengineering במודלים עכבר ללמוד hematopoiesis רגיל וממאיר 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , tumorigenesis, וגרורות 40 , 41 , 42 , 43 , 44 .

בהתבסס על ניסיון קודם בהנדסת רקמות עצם ובדמיית vivo 19 , 22 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 , אנו מתארים פרוטוקול של bioengineer ו- live-image organotypic BM tissues אנושיים. מבנים אלה מקורם בהשתלה של תאים אנושיים המופקעים על ידי BM- אדם לתוך פיגומים מבוססי קולגן תת עורית מורכבים בעכברים החיסוניים. בדו"ח הקודם, הראינו כי MSCs אנושי להבטיח את הקמתה של microenvironment האדם מתאים engraftment של תאים hematopoietic האדם 45 . יתר על כן, כאן אנו מתארים כיצד שיתוף ההשתלה של מרכיבי האדם האחרים סלולרS, כגון תאי אנדותל אנושיים (hEC) ו / או ציטוקינים חשובים להיווצרות עצם ( למשל, hBMP2), משתפים פעולה עם hMSC כדי ליצור microenvironments אנושיים שונים, אשר ניתן לחיות הדמיה באתרם .

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו תחת PPL 70/8904, שאושרו על ידי המשרד הבריטית בבריטניה ובהתאם להנחיות בבריטניה למחקר סרטן. השימוש בדם טבורי אנושי (UCB) ובדגימות מוקדמות של לוקמיה מיאלואידית אנושית (AML) אושרה על ידי הוועדה האתית של מזרח לונדון לאחר קבלת הסכמה ונעשתה בהתאם להצהרת הלסינקי. 1. Bioengineering קולגן מבוסס פיגומים עם תאים hematopoietic ו סטרומה האדם הערה: הפרוטוקול כולו צריך להתבצע בתנאים סטריליים עם חומר סטרילי. בינוני תרבות התא 1 מתאים בינוני hMSC (MEM-α, P / S, ו 10% hMSC-FBS); (M199, 20% FBS, P / S, 10 מ"מ HEPES, 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​הפרין, 2 גלוטמין מ"מ ו 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​ECGS) ו בינוני תרבות התא 3 מתאים בינוני תא hematopoietic (H5100 ו P / S). הכן דם טבורי דם mononuclear תאים (-MNCs CB) או עיקרי AML (מח עצם או MNCs דם ההיקפי) באמצעות שיפוע צפיפות Ficoll-Paque, על פי פרוטוקולים ומבוססים 53. עבור AML, לרוקן את תאי T באמצעות נוגדן OKT.3. דגירה 4 מיקרוגרם של OKT.3 לכל 1 x 10 6 MNCs AML במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לפני שטיפת התאים PBS. אם נדרש, cryopreserve MNCs ב FBS עם 10% DMSO ב 2 x 10 8 תאים לכל מ"ל. הכן hmsc (בינוני תרבות 1) ו EC (תרבות בינוני 2) תרבויות התא. פלייט תאים hMSC (ראה טבלה של חומרים ) על צלוחיות התרבות הרגיל תא במדיום hMSC. צלחת ECs (ראה טבלה של חומרים ) על קולגן 1 מצופה משטחים במדיום EC. ב 85-90% מפגש תא להסיר את המדיום, לשטוף פעמיים עם PBS, ולהוסיף פתרון טריפסין-EDTA (20 μL לכל ס"מ 2 ). לאחר 5 דקות, לבדוק כי התאים מנותקים. לשחזר את התאים על ידי דילול 1:3 עם בינוני בתרבית תאים. צנטריפוגה ב XG 300 במשך 5 דקות מחדש להשעות במדיום המתאים עבור כל סוג התא לספור את התאים באמצעות תא Neubauer. השתמש בתאים ב 2 x 10 6 – 10 7 תאים לכל מ"ל. אם שני סוגי התאים צריכים להיות בשימוש יחד, לערבב את hMSC ו EC השעיות ביחס 1: 1. מעבירים את ההשעיה התא מזרק אינסולין. בעזרת איזמל, לחתוך את ג 'לטים מעוקרים ג' לטין ( למשל, gelfoam) פיגום הראשונית (20 מ"מ x 60 מ"מ x 7 מ"מ) לתוך 24 חתיכות בגודל דומה (6.6 מ"מ x 7.5 מ"מ x 7 מ"מ, איור 1A ו- B ). לשחזר ג 'לטין פיגומים ידי טבילה PBS (5 דקות). אחד אחד, בעדינות לשים את הפיגומים על רקמה סטרילית להסיר עודף PBS. מעבירים את הפיגומים היטב אחד של צלחת 24 גם (משטח מצורף נמוך במיוחד) ולהשתמש מזרק להזריק 50 μL המכיל 10 5 – 10 6 תאים (hMSC אלאחד או בשילוב עם hEC; איור 1 ג ). חזור על שלב 1.7 עם כל פיגום עד כל הפיגומים הדרושים הם seeded עם תאים סטרומה. לדגור על 1 שעות בתוך חממה תרבות התא (37 ° C ו CO 2 5%). ממלאים כל טוב עם 3 מ"ל של המדיום תרבית תאים 1 ( איור 1D ) ולהחזיר את הפיגומים לתא חממה תאים (37 מעלות צלזיוס CO 2 5%) עבור הדגירה לילה. השתמש בתרבית תאים 2 בינוני אם ECs משמשים פיגומים. להפשיר CB-MNCs לבודד CD34 + תאים מהם בעקבות פרוטוקול מתאים CD34 + סעיף ערכת. להשעות את CD34 + תאים נבחרים בינוני 3 ולספור אותם בחדר Neubauer. הערה: כאן, תאים שימשו בריכוז של 2 x 10 6 תאים לכל מ"ל. אם AML המטופל נגזר דגימות ראשוניות משמשים, להפשיר את התאים, לדלל אותם 1:10 ב FBS, צנטריפוגה אותם 5 דקות ב 300Xg, resuspend התאים PBS-2% FBS, להוסיף נוגדן CD3 אנטי אנושי (2 – 4 מיקרוגרם לכל 10 6 תאים), ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. צנטריפוגה 5 דקות ב 300 xg ו resuspend במדיום התא hematopoietic בתוספת ציטוקינים (20 ng / מ"ל ​​גרנולוציטים המושבה מגרה גורם (G-CSF), 20 ng / mL IL-3, ו 20 ng / mL thrombopoietin (TPO)) . חזור על שלבים 1.7 – 1.9 אבל במקרה זה זרע 1 x 10 5 תאים hematopoietic האדם במקום מרכיבים stromal, כאמור לעיל. מילוי היטב עם 3 מ"ל של המדיום בתרבית תאים 3 ( איור 1D ) ולהחזיר את הפיגומים לתא חממה תאים (37 מעלות צלזיוס CO 2 5%) עבור הדגירה לילה. השתמש תערובת 1: 1 של התקשורת בתרבות תאים 2 ו 3 אם ECs משמשים הפיגומים. עבור רק רקומביננטי העצם האנושי morphogenetic חלבון -2 (rhBMP-2) פיגומים המוביל, בעדינות לשים את הפיגומים אחד אחד על רקמה סטרילית כדי להסיר עודף PBS מעבירים את הפיגומים היטב אחד של U-bottom, צלחת 96-היטב ( איור 1E ) ולהוסיף 5 μL של rhBMP-2, ביסודיות מכסה את הפיגום. הוסף 20 μL של טרומבין ואחריו 20 μL של פיברינוגן, ביסודיות מכסה את הפיגום בכל פעם ( איור 1F ). חזור על ההליך עבור כל פיגום עד כל הפיגומים הנדרשים מטופלים ואז דגירה של 5 – 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בדוק אם קרישה נוצר בהצלחה. 2. כירורגי ההשתלה של פיגומים Bioengineered הערה: כאן, או זכר או נקבה, 6 עד 12 שבועות עכברים NSG היו בשימוש. כמו בעלי חיים הם immunodeficient, כל ההליכים צריכים להיעשות בתנאים סטריליים. שלבים 2.10 – 2.13 קשורים לאסטרטגיות הישרדות וטיפול לאחר ניתוח. 60 – 120 דקות לפני הניתוח, תת עורית מתן תרופות כאב (carprofen, 5 מ"ג / ק"ג bodyweight / עכבר). להשרות הרדמה בחדר עם 0.5% isoflurane ו 2 L / min O 2 . עכברים יש לעקוב ברציפות במהלך ההליך. מעבירים את החיה לאזור הניתוח במצב נוטה על מנת לקבל גישה קלה לגב. שמור את החיה תחת הרדמה באמצעות חרוט האף אספקת 1.5% isoflurane ו 2 L / min O 2 . שמור את העכבר תחת הרדמה במהלך הליך כירורגי לעתים קרובות לבדוק את מצב החיית. בעוד זה תחת הרדמה, השתמש ג'ל עיניים על העיניים של העכבר כדי למנוע יובש, ולשמור על העכבר על 37 מעלות צלזיוס. לגלח את האזור כירורגית על החלק האחורי של העכבר באמצעות גוזם חשמלי. כדי לעקר את העור, לטבול קצה כותנה ב clorexidine מדולל (בדילול 01:10 ב PBS) ולהשתמש טיפ זה כדי לנקות את פני העור. חזור על הליך זה פעמיים. באמצעות מלקחיים סטרילית ואת אזמל (או מספריים), לעשות חתך 0.5-0.7 ס"מ הקדמי אל החלק האחורי של העור. השתמש מלקחיים מוכנסמתחת לרקמה תת עורית כדי ליצור כיס. הכנס את הפיגום תת עורי, ולוודא כי הוא ממוקם עמוק בתוך הכיס ( איור 1G ו- H ). סגור את החתך עם דבק כירורגי ( איור 1I ו- J ). כדי לטפל בכאב שלאחר הניתוח, תת עורית בופרנורפין (0.1 מ"ג / ק"ג משקל גוף). במהלך ההתאוששות, במקום החיה על צדה בכלוב מחומם מראש לפקח על ההתאוששות עד התנהגות נורמלית הוא ציין. לדלל את כאבים תרופות במים (carprofen, 0.1 מ"ג / מ"ל ​​של מים) ולספק אותו לבעלי חיים כמו מי שתייה במשך 4 ימים לאחר הניתוח. בדוק את החיה ואת הפצע לעתים קרובות במהלך 48 שעות לאחר ניתוח שלאחר תקופה של תופעות לוואי אפשריות. 3. עכבר טיפולים, המתת חסד, ואחזור הדגימה עבור הדמיה הערה: ניתוח הפיגומים מתבצע בין8 ו 24 שבועות לאחר ההשתלה. 60 דקות לפני ההדמיה, לשמור על העכבר מושתל חם בתיבת חימום על 37 מעלות צלזיוס ו תוך ורידי לנהל 100 μL של אימונוגלובולין האדם לחסום אתרים שאינם ספציפיים. 30 דקות לפני הדמיה, תוך ורידי לנהל 10 מיקרוגרם (לכל עכבר) של נוגדנים ספציפיים לתווית התאים של עניין. 5 דקות לפני הדמיה, תוך ורידי לנהל 15 μL (מדולל μL 100 של PBS) של 655 ננומטר fluorophore שכותרתו, סוכן- pooling סוכן (655-VPA) לדמיין מבנים וסקולריים. להרדים את העכבר באמצעות נקע צוואר הרחם. בעזרת מספריים חדים, לעשות חתך עור אורך על החלק האחורי של העכבר, ליד האתר ההשתלה המקורי. בעזרת פינצטה ומספריים, בזהירות להפריד את העור מהכיס תת עורית שבו הפיגום כבר מושתל. החזק את הפיגום עם פינצטה בעדינות explant אותו מן העור על ידי חיתוך הממברנה שיורית אNd רקמות סביב הפיגום באמצעות מספריים. ראה דוגמאות של פיגומים להיות התאושש באיור 2 . לאבטח את הפיגום עם דבק דבק מהיר משחק לצלחת הדמיה (35 מ"מ x 10 מ"מ צלחת פטרי) ולמלא עם תמיסת מלח (PBS) בטמפרטורת החדר. עבור פיגומים BMP, לפני מילוי הצלחת עם PBS, השתמש microdrill כירורגית כדי לדלל את משטח העצם תחת מיקרוסקופ microsurgical; זה מאפשר הדמיה fluorophore ו תמונה ברזולוציה גבוהה ללכוד. השתמש או 1.2 או 1.6 מ"מ קוצים, בהתאם לגודל של הפיגום. הערה: המשתמש יבין כמה לקדוח בהתאם לעובי של העצם. באופן כללי, כמו הפיגומים BMP הם כלי הדם, העצם יהיה לשנות מעט צבע ולהיות אדום יותר כאשר מתקרבים לעובי הנכון עבור הדמיה. הכנס את הצלחת על הבמה של המיקרוסקופ confocal. 4. Live- הדמיה באמצעות שני פוטון מיקרוסקופאופיי הערה: בעת שימוש בגלאים שאינם descanned (NDD), השתמש תמיד במחוון NDD עבור הדמיה כדי לכוון את הקרינה ל- NDD. תצורת מיקרוסקופ מסופק באיור 3 . הפעל את המיקרוסקופ ואת המחשב, הפעל את התוכנה על ידי לחיצה על "התחל מערכת", ועבור למצב "רכישה". סמן את התיבה "הצג כלים ידניים". ב "לייזר" בתפריט לעבור "על" לייזר פוטון שני ולאפשר לו להתחמם ולייצב. בתפריט "הדמיה התקנה", הפעל בו זמנית את "מצב ערוץ" ו "עקוב אחר כל מסגרת." בתפריט "אור נתיב", בחר "לא Descanned" ו "ראשי Beam Splitter MBS 760 +." סמן כדי להפעיל את 4 NDDs ולהגדיר את התצורה כפי שמוצג באיור 3 . הערה: עם תצורה זו, אות קולגן ממבני עצמות (secOndd הרמוני, SHG) נאסף ב 380-485 ננומטר, FITC-hCD31 + תאים אנדותל האדם AF488- hCD45 + תאים hematopoietic האנושי ב 500-550 ננומטר, ו 655-VPA ב 640 – 690 ננומטר. בתפריט "ערוצים", הגדר את "אורך הלייזר" ל -890 ננומטר ואת הכוח ל -50%. הגדר את "רווח (מאסטר)" ל 500-600, "היסט דיגיטלי" ל 0, ואת "רווח דיגיטלי" ל 15 עבור כל ערוץ. התאמת ערכים אלה לאחר הרכישה החלה. ב "מצב רכישה," להגדיר את הפרמטרים הנדרשים כדי לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה מבלי לפגוע הרקמה הלבנה fluorophores. הגדר את "מצב סריקה" ל "Frame", "Frame Frame" ל "x512 y512", "Line Line" ל – 1, "Speed" ל – 9, "מספר ממוצעים" ל – 8, "Bit עומק" ל – "8 Bit" מצב "ל" קו "," כיוון "ל" דו כיווני ", ו" שיטה "ל" מתכוון ". הגדר את "ZoOm "ל 1 עבור הסריקה הראשונית של התמונה, ולהגדיל אותו אם נדרש להתמקד באזורים מסוימים. מניחים את הצלחת המכילה את הפיגום על הבמה מיקרוסקופ מתחת לעדשה 20X, 1.0 NA טבילה במים ולהוריד את העדשה עד שהיא נוגעת הפתרון מלוחים. הגדר את המיקוד של העדשה על פיגום באמצעות עינית מיקרוסקופ, באמצעות מנורה כמקור האור. הפעל את התפריט "Z-Stack", בחר בפונקציה "First / Last", והגדר את המרווח הדרוש בין שתי פרוסות משנה עוקבות ( לדוגמה, 2-μm Z-stack). שמור את מרווחי intervals בתוך Z- מחסנית. בחר "Live" לתמונה סריקה חיה של המדגם ולהתאים את "דיגיטלי רווח" ו "דיגיטלי אופסט" עבור חשיפה אופטימלית. כדי לדמיין ערוצים מרובים בו זמנית, בחר את הפונקציה "פיצול". בתפריט "שלב", כאשר במצב "Live", סרוק את התמונה ואת "סמן" אזורים של interEst (ROI), כגון המיקום של תאים hematopoietic האדם ומבנים וסקולריים. כאשר הסריקה של המדגם הושלם, לעבור החזר ההשקעה הראשונה להתחיל הדמיה. במצב "Live", הגדר את החלק העליון והתחתון של מחסנית התלת-ממד המקיפה את אזור העניין באמצעות הפונקציות "Set first" ו- "Set Last". לאחר סיים, להגדיר את המרכז, "ג" התחל את הרכישה של ההחזר על ההשקעה עם כפתור "התחל הניסוי". ראה דוגמאות לתמונות באיור 4 , איור 5 ואיור 6 . לאחר השלמת הרכישה, שמור את התמונה בתיקיה המיועדת. עבור אל החזר ה- ROI הבא וחזור על שלב 4.10. לאחר הניסוי הושלמה, להסיר את צלחת הדמיה מהמיקרוסקופ, בזהירות לנתק את המדגם מהצלחת, ולנקות כל דבק שיורית. הכן את המדגם עבור הטכניקה הבאה ניתוח. 5. תהליך ProcessinG עבור היסטולוגיה ו Immunostaining הערה: דוגמאות מעובדות בהתאם לפרוטוקול המתואר בטכניקות המעבדה הכללית של JoVE 54 המתארות קיבוע מדגם, הטבעה ותהליכי חתך. דגימת העצמות צריכה להיות מטופלים במשך 7 ימים בסוכן decalcifying מבוסס EDTA בין קיבוע תהליכי הטבעה. פתרון חסימה / permeabilization הוא 10 מ"מ PBS pH 7.4 חיץ עם 1% Triton X-100, אלבומין 1% בסרום אלבומין (BSA), ו 10% בסרום עזים נורמלי (NGS). שים את פרוסות קסילן במשך 10 דקות), קסילן במשך 5 דקות, אתנול 100% במשך 5 דקות, אתנול 70% במשך 5 דקות, אתנול 50% עבור 5 דקות, ו H 2 O במשך 5 דקות. מעבירים את הפרוסות לפתרון מבוסס אנטיגנים המבוססים על ציטראט. מרתיחים את הפרוסות במשך 15 דקות ולאפשר להם להתקרר לטמפרטורת החדר. לשטוף את פרוסות 10 מ"מ PBS pH 7.4 פתרון עם 1% Triton X-100 (5 דקות, 3 פעמים). מעבירים את הסםPles לפתרון / חסימה permeabilization ו דגירה במשך 30 דקות. הוסף נוגדן ראשוני מדולל בחסימה / פתרון permeabilization ו דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף את פרוסות 10 מ"מ PBS pH 7.4 פתרון עם 1% Triton X-100 (5 דקות, 3 פעמים). הוסף נוגדנים משני מדולל בחסימה / פתרון permeabilization עבור 1 שעות בחושך בטמפרטורת החדר. לשטוף עם H 2 O (5 דקות, 3 פעמים). כדי להפחית את הקרינה ברקע, לטבול את פרוסות סודאן עבודה שחור פתרון במשך 10 דקות, בחושך בטמפרטורת החדר. לשטוף את פרוסות H 2 O (5 דקות, 3 פעמים). הר פרוסות באמצעות המדיום גובר ניאון עם DAPI (0.5 מיקרוגרם / מ"ל). אחסן את פרוסות ב 4 ° C ו לבדוק כי המדיום גובר יבש לפני ביצוע הדמיה פלואורסצנטי. ראה דוגמאות לדוגמה בתרשים 7 .

Representative Results

באיור 1 , תמונות נציג של זריעת תאים פיגום ותהליכי ההשתלה מוצגים. בתרשים 1C , שים לב תאים מוזרקים ישירות לתוך הפיגום. בתרשים 1G , שים לב כי חתך נעשה בחלק האחורי של העכבר, שם נוצר כיס תת עורית ואת הפיגום הוא מושתל. איור 2 מציג את המורפולוגיה ברוטו של פיגומים שונים מושתלים בעכברים NSG ואחזר לאחר 8 שבועות. הערה וסקולריזציה קלה hMSC פיגומים פיגומים ( איור 2 א ). שיתוף זריעת של ECs אנושיים עם hMSCs ב פיגום מאפשר להיווצרות של כלי הדם הרלוונטיים יותר פיגומים ( איור 2 ב ). לבסוף, הנוכחות של rhBMP-2 מעוררת היווצרות עצם. את הפיגומים אחזור הם גדולים יותר במקרה זה, והם מיוצרים על ידיעצם הדומה לרקמה קשה. איור 3 מציג את הגדרת תצורת הערוץ על המיקרוסקופ עבור הדמיה חיה עם NDD (פרטים באגדה דמות). איור 4 ווידאו 1 להראות תאים hematopoietic האדם himsc מצופה פיגומים. פיגומים היו explanted 8 שבועות לאחר ההשתלה ואחרי חיסון תוך ורידי של נוגדן AF488-hCD45 ו 655-VPA. הליך זה מאפשר הדמיה של תאים hematopoietic מושתל האדם ואת מבנה כלי הדם על ידי מיקרוסקופ שני photon confocal. במקרה זה, התמונות מראות כלי דם (655-VPA) בפיגומים ואת engraftment לטווח ארוך של תאים hematopoietic האדם (AF488-hCD45) ב parenchyma הפיגום. איור 5 ווידאו 2 מתאימות פיגומים האדם seeded עם hECs ו hMSCs. 8 שבועות לאחר הניתוח, פיגומים היו explanted לאחר intravenחיסון ous של FITC-hCD31 נוגדן ו 655-VPA, ותמונות נרכשו עם מיקרוסקופ confocal שני פוטון, כאמור לעיל. תמונות להראות את ההשתתפות של hecs במבנה כלי שיט בתוך הפיגום, וכתוצאה מכך וסקולטור chimeric האדם Murine. איור 6 א מציג נתונים נציג של הגישה המשמשים לעורר היווצרות עצם פיגומים MSC. בדומה לנתונים קודמים, 8 שבועות לאחר ההשתלה, בוצעה חיסון תוך ורידי של 655-VPA, פיגומים נלקחו, ותמונות נרכשו עם מיקרוסקופ שני פוטון confocal. RhBMP-2-פיגומים מעוררים לגרום להיווצרות רקמות עצם, אשר יכול להיות דמיינו בשל SHG (צבע ציאן בתמונות) המסופקים על ידי סידן בעצם. התמונות שסופקו גם מראים את היווצרות חללים ורקמות אנדוסקטל וסקולרי, אשר דומה מאוד לרקמה endosteal BM. באיור 6 ב </sTrong> ו וידאו 3 , hECs היו שיתוף implanted עם hmscs. פיגומים נלקחו לאחר חיסון תוך ורידי של נוגדנים FITC-hCD31 ו 655-VPA, ו -2 פוטון תמונות מיקרוסקופיה confocal להראות את השתתפותם של hECs ב neovascularization ב פיגום העצם להרכיב. איור 7 מציג תמונות מייצגות של היסטולוגיה, הליך המבוצע כדי לאשש תוצאות שתוארו לעיל. תמונות Immunofluorescent להראות vasculature העכבר, hECs, hMSCs, ו לטווח ארוך engrafted תאים hematopoietic האדם במבנים פיגומים. פיגומים שנלקחו עכברים היו קבועים המשמשים immunofluorescence. ב rhBMP-2 נושאת עצם הפיגום פיגומים ( איור 7D -F ), לציין את המורפולוגיה של הרקמה, הדומה מוח העצם בוגרת עם רקמת השומן. ב פיגום זה עצם ליצירת, אנו מראים כי hMSCs הם fibroblasts, אשר יציין tהם תורמים לרקמה שזה עתה נוצרה כתאי סטרומה. כמו כן, אנו מראים ביטוי סמן אדיפוציטים אנושיים, אשר יציין כי hMSCs גם לתרום היווצרות רקמות השומן. איור 1. נציג תמונות של זריעת תאים ותהליכי ההשתלה. א) פיגום ראשוני ושיטת חיתוך שלה באמצעות איזמל. ב) 24 חתיכות המתקבל פיגום הראשוני. ג) פיגומים תא הזרוע בשיטה באמצעות מזרק. D) פיגומים Cell seeded עם בינוני תרבות, מוכן להיות מושתל. EF) צעדים ספציפיים עבור הפיגום העצמות: E) הפיגום מועבר צלחת 96-well, U- התחתון ו F) נציג תמונה של השיטה המשמשת כדי להוסיף rhBMP2, thrombin, ופיברינוגן על הפיגום. GJ) הליך ההשתלה Cal תחת הרדמה כללית: G) הפצע נוצר בהשתלת העור ואת פיגום, H) שיטת ההשתלה, IJ) הפצע הליך הסגירה באמצעות דבק כירורגי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2. פיגומים שונים מאוחזרים עכברים. תמונות נציג של MSC פיגומים (משמאל), MSC + EC פיגומים (באמצע), MSC + EC + BMP פיגומים (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. 4 / 55914fig3.jpg "/> איור 3. תצורת ערוץ. המסנן מיקרוסקופ ההתקנה מוצג. א) ישנם ארבעה מודולים NDD גלאי: במודול הראשון, יש שני קוביות מסנן; המודולים השני והשלישי יש קובייה אחת מסנן כל; ואת המודול האחרון אין קובייה (לא בשימוש). צינור מכפיל ראשון (PMT) הוא עבור ערוץ אדום רחוק (640 – 690 ננומטר), המשקף את אורכי הגל התחתון; אלה הם 380 – 485 ננומטר, 500 – 550 ננומטר, ו 555 – 625 ננומטר (הסדר הוא תמיד מן הגל התחתון עד גבוה). ב) פליטות fluorophore לגילוי עם תצורות לעיל (מקודד צבע). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 4. MSC פיגום S לאפשר גיבוש של נישה עבור תאים heatopoietic האדם. A) ו- B) השחזור 3D של Z- ערימות נלקח שלאחר אקספלנט, לאחר חיסון תוך ורידי עם AF488-hCD45 (ירוק), כדי התווית תאים hematopoietic האדם, ו 655-VPA (מגנטה) מ כדי תווית כלי הדם. סולם ברים מייצגים 20 מיקרומטר A ו- B (לוחות העליונים) ו 5 מיקרומטר ב (לוחות התחתון). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. וידאו 1. MSC פיגומים לאפשר לגיבוש של נישה עבור תאים heatopoietic האדם . שחזור 3D של תאים hematopoietic האדם (AF488-hCD45) הקשורים עם כלי הדם (655-VPA) ב MSC פיגום (מבנים קולגן: SHG, ציאן). כל ערימה אמצעים 140 x 140 מיקרומטר.Ef = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video1.mov" target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד). איור 5. ECs האדם להשתתף בהצבת כלי רכב הומאניים ב MSC פיגומים. שחזור 3D של כלי הדם (655-VPA) בשורה של ECS ממוצא אנושי (FITC-hCD31) ב MSC + EC פיגומים. פסי סולם מייצגים 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. וידאו 2. אנושי ECs להשתתף בעיצוב של כלי אנושי ב MSC פיגומים. שחזור 3D של ECs האדם (FITC-hCD31) רירית VA Sculature (655-VPA) ב MSC + EC פיגומים. כל ערימה אמצעים 240 x 240 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד). איור 6. rhBMP-2 פיגומים נושאות יש משטחי העצם וסקולטור אנושי דומה מח עצם. א) שחזור 3D של MSC + BMP פיגומים מראה את היווצרותם של מבנים עצם (SHG- ציאן) ו כלי הדם (655-VPA). סולם ברים מייצגים 100 מיקרומטר (משמאל), 70 מיקרומטר (באמצע), ו 50 מיקרומטר (מימין). ב) שחזור 3D של MSC + EC + BMP פיגומים מראה כלי אנושיים (655-VPA) בשורה עם ECs האדם (FITC-hCD31). סולם ברים מייצגים 50 מיקרומטר (משמאל) ו 30 מיקרומטר (באמצע וימין).14 / 55914fig6large.jpg "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. וידאו 3. rhBMP-2 המוביל פיגומים יש משטחי העצם וסקולטור אנושי דומה מח עצם. שחזור 3D של MSC + VERA + BMP פיגום (העצם: SHG; כלי: 655-VPA, ECs האדם: FITC-hCD31). כל ערימה אמצעים 600 x 600 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד). איור 7. נציג תמונות של Immunofluorescence מבוצע על פיגומים קבועים. AF) מחקרים Immunofluorescence לבצע לאיתור תאים אנושיים מושתל אניN פיגומים. AC) פיגומים מושתלים עם HECs, hMSCs, ו hHSCs. DF) עצם פיגומים המושתלים עם hECs, hMSCs, ו hHSCs. ערוצי הצבע הם כדלקמן: AD) האדם EC (hed31) ומבנה כלי הדם העכבר (endomucin, ENDOM), BE) hMSCs (hVimentin, hVIM) ואת תאי כלי הדם העכבר (endomucin, ENDOM), C) תאים hematopoietic האדם (hCD45) ו vasculature העכבר (endomucin, ENDOM), ו F) האדם שומן השונה חלבון הקשורים (hADRP) ו vasculature העכבר (endomucin, ENDOM). סולם ברים מייצגים 10 מיקרומטר (A ו- C), 20 מיקרומטר (B ו- E), ו 40 (D ו- F) מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

משמעות ביחס לשיטות הקיימות:

בפרוטוקול זה, תיארנו שיטה ליצירת microenvironments אנושית שונים בעכברים כדי לדמיין את הארכיטקטורה שלהם באמצעות מיקרוסקופ שני פוטון היסטולוגיה. הנתונים המייצגים שסופקו מראים את ההיתכנות של הגישה, תוך שימוש בתאים סטרומה שונים להנדסת רקמות אנושיות. הפרוטוקול יש יישומים ספציפיים לחקר תאים hematopoietic האדם תאים מוח העצם נגזרות בתנאים נורמליים ופתולוגיים. יישומים אלה כוללים את המחקר של האבולוציה המשובצת, בדיקות סמים, crosstalk בין HSCs האדם רכיבים סטרומה. בתחום המתפתח של הנדסת רקמות, כמה גישות חלופיות הוצעו. גישות של הערה כוללים את הפיתוח של מבנים תלת מימדיים בבני אדם במבחנה 55 , 56 , 57 ,S = "xref"> 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 ואת השתל אורתופוטיק של פיגומי BM אנושיים בעכברים 64 . הגישה שלנו יש את היתרון של שילוב הן המורכבות של מערכת vivo עם נגישות אנטומית קלה של שתל רקמות אנושית.

שינויים ופתרון בעיות:

מקור השתנות בפרוטוקול זה ניתן למצוא את הבחירה של תאים המשמש זרע את הפיגומים. בעבודה שלנו, השתמשנו BM- נגזר hMSCs. עם זאת, תאים mesenchymal ניתן להשיג מספר רקמות, אשר עשוי להראות מאפיינים ייחודיים בהתאם למקור. לכן, השימוש hMSCs נגזר איברים שונים יכולים להיחשב. עם זאת, היכולת שלהם ליצור רקמת עצם in vivo יש לבדוק לפני השימוש זה עמ 'פרוטוקול rotocol.This משתמשת מסחרית זמין בתא האדם האנדותל ( כלומר, E4ORF1-transduced HUVEC). לאחרונה, השימוש בתאי האנדותל ספציפיים עבור איברים למטרות שונות כבר דיווח 65 , 66 . יתר על כן, השימוש hECs העיקרי נגזר BM יכול לייצג שיפור מעניין לפרוטוקול. לכן, השימוש במקורות שונים של תאים אנדותל עשוי לייצר תוצאות שונות vivo .

השתמשנו NSG immunocompromised עכברים המקבל לטובת השתלת פיגומים אנושיים כדי למנוע דחייה רקמות. אנחנו לא שוללים את האפשרות של שימוש בפרוטוקול זה כדי להנדס רקמות מוח עצם ectopic זנים העכבר אחרים. ואכן, rhBMP-2 יכול לעורר היווצרות עצם במודלים שונים של יונקים 47 , 48 , 49 , 50 <sup>, 52. עם זאת, הבדלים הכדאיות התא השתלות לטווח ארוך צפויים להיות נצפו באמצעות זנים שונים / דגמים.

עיתוי התאוששות הפיגומים יכול גם להיות גמיש, בהתאם המטרה הסופית של הניסוי. בפרוטוקול המוצג, אנו לשחזר דגימות ב 8-12 שבועות לאחר ההשתלה להעריך engraftment hematopoietic לטווח ארוך. כדי לחקור את השלבים המוקדמים של היווצרות האדם בנישה BM ( למשל, היווצרות רקמות אוסטאוכונדרל 47 או התפתחות כלי הדם), נקודות זמן שונות ניתן לבחור.

טכניקת הדמיה חיה שתיארנו בפרוטוקול זה מסומן עבור הדמיה לטווח קצר של explants. השימוש בתא equilibrated לשמירה על טמפרטורה פיזיולוגית, מתח חמצן, ריכוז CO 2 צריך להיחשב במקרים של הדמיה לטווח ארוך, כגון ללמוד התנהגות התנהגויות.

רחוב קריטיאפס בתוך הפרוטוקול:

בין האתגרים הקשורים בפרוטוקול, היינו להדגיש את הכישורים הטכניים הדרושים כמה צעדים. Mesenchymal ותאי האנדותל יש להשתמש במספר נמוך תא המעבר; אחרת, הם לא יוכלו לתמוך engraftment hematopoietic תא in vivo או להשתתף wasculature נובו דה עצם היווצרות in vivo . אנו ממליצים להשתמש hMSCs ו hECs על מעברים 1 – 5. הכנת הפיגום ושלבים זריעת תאים דורשים בסיסי התרבות תאים מיומנויות וידע של המאפיינים של תאים ספציפיים בשימוש בהליך. פרוטוקול הניתוח הוא פשוט למדי, אבל דורש קצת תרגול. תחזוקה של סביבה aseptic כדי למנוע זיהום של פיגומים מושתלים בעכברים immunodeficient חיוני כדי להבטיח את הצלחת הניסוי. לדוגמה explant ו הדמיה לחיות דורשים כירורגית בפועל (במיוחד עבור השימוש של microdrill) וידע שלמערכת מיקרוסקופ. לבסוף, עיבוד דגימה והיסטולוגיה דורשים ידע בסיסי של הטכניקות לשימוש.

מגבלות הטכניקה:

הגישה שאנו מתארים מאפשרת הדמיה של תאים חיים hematopoietic חיים האדם זריעת microenvironment מוח העצם האנושית, עם תאים האנדותל האנושי ויוצרים מבנים וסקולריים תאים mesenchymal ויצירת העצם / מרחב מוח העצם. כמו הרקמה נוצרת in vivo , הפיגום הסופי מהונדסים עדיין יהיה chimeric (האדם ואת Murine). בעיה זו צריכה להילקח בחשבון, כמו רקמה chimeric לא יכול לחקות באופן מלא המורכבות מוח העצם האנושי והסביבה.

פיגומים מושתלים יש גודל מוגבל (ניסינו מקסימלית של 6.6 x 7.5 x 7 מ"מ), ולכן, הם יכולים לארח מספר מוגבל של תאים xenotransplantation. המספר המוחלט של תאים התאושש יהיה גם מוגבל; ולכן, מספר פיגומים מושתל צריךיחושב כפונקציה של מספר התאים הנדרשים לניסוי.

יישום הדמיה שתיארנו הוא שימושי במיוחד עבור תצפית על שטחים גדולים של רקמה חיה בעומקים של 150-200 מיקרומטר מפני השטח מבלי לשבש את הארכיטקטורה ופגיעה בתאים. לכן, הוא אינו מאפשר הדמיה של כל הפיגום. אם סריקה מלאה של הרקמה נדרשת, גישות immunofluorescence תקן יהיה מתאים יותר.

יישומים עתידיים:

הכיוון העתידי של המודל הביו-הנדסי הזה יהיה להגדיל את המורכבות של המרכיבים האנושיים ברקמה. הידע והאפיון של גומחת האדם האנושי התקדמו בשנים האחרונות 67 , והפרוטוקול המתואר יכול להיות פלטפורמה מעניינת לחקור את תפקודם של מרכיבים אלה של תאים חדשים ושל גורמים מסיסים, כמו גם את תפקידם בתמיכה נורמלית /HSCs נמלים.

יתר על כן, טכניקת הדמיה מספקת את הפוטנציאל הדמיה intravital של הפיגומים במחקרים אורך, אשר ידרוש שיפורים טכניים הדמיה הפיגומים בעכברים חיים, הרדים, עם ההתאוששות שלאחר הניתוח. גישה זו תידרש צעדים נוספים והיא נמצאת כעת במעבדה במעבדה.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לעובדים במתקני הליבה במכון פרנסיס קריק (מתקן מחקר ביולוגי, בויו דימות והיסטופתולוגיה ניסיונית) ויולנדה סאבדרה-טורס ומרצדס סאנצ'ס-גרזון, הווטרינרים בקריק וב- LRI בהתאמה, על עזרתם החשובה. אנו מודים לד"ר וו גריי על קריאת כתב היד. DP נתמך על ידי עמית מחקר קליני של EHA. עבודה זו נתמכה על ידי מכון פרנסיס קריק, שמקבל את המימון הליבה שלו ממחקר הסרטן בבריטניה (FC001045), המועצה למחקר רפואי בבריטניה (FC001045), ואת Welcome Trust (FC001045).

Materials

Ficoll-Paque Ge Healthcare 17-1440-03
Cd34 positive selection Kit Stemcell 18056 Store a 4°C.
Magnet Stemcell 18000
Anti-human CD3 antibody, clone OKT-3 Bioxcell BE0001-2 Store at 4°C. Used for T cell depletion in primary AML samples. 
Cytokines (IL3, G-CSF, and TPO) PeproTech 200-03, 300-23 and 300-18 For doing the stock: Dilute each one of the cytokines in 100μL of water and mix them. Add 200μL, do alicuots of 45μL and Store at -20°C.
DMSO Sigma D4540
FBS Life technologies 10270106 Heat-inactivate at 56°C during 30 minutes, do aliquots and freeze down. Warm in 37°C water bath before use.
MEM-α Invitrogen 32571-028 Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use.
Myelocult H5100 corning 5100 Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use.
199 Gibco 41150-020 Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use.
hMSC-FBS, Heat-inactivated Gibco 12662-029 Store at -20°C. Warm in 37°C water bath before use.
P/S Sigma-Aldrich P0781 Store at -20°C. Warm in 37°C water bath before use.
ECGS Millipore 02-102 Dilute in culture media and use 0.22 mm filter.
HEPES Sigma-Aldrich S1558-50ML Store at 4°C.
Heparin Sigma-Aldrich H3149 Store at 4°C.
Glutamine Gibco 25030 Store at -20°C.
Collagen 1 coated cell culture plate corning 354505
Trypsin-EDTA solution Thermo-Fisher 25200056 Store at -20°C. Warm in 37°C water bath before use.
hMSC Lonza PT-2501 Alternatively, hMSCs we also kindly provided by Dr. Dosquet (University Paris Diderot, Paris) from human bone marrow obtained during orthopaedic surgery under ethical approval 10-038 from IRB00006477. 
VeraVec HUVEC endothelial cells Angiocrine bioscience hVera101
Human hematopoietic cells Umbilical Cord blood or primary Acute Myeloid Leukemia (AML) samples were obtained from the Royal London Hospital (London, UK) after informed consent and protocol of use was approved by the East London Ethical Committee and carried out in accordance with the Declaration of Helsinki. 
Gelfoam, Size 12-7mm Pfizer 00009-0315-08
PBS Thermo-Fisher 10010023
Surgical material Multiple Sterile forceps, tweezers and sharp scissors.
Sterile tissues Heat-sterilize paper tissues.
1 ml Syringe with needle of 25G Terumo SS+01H25161
Ultra Low Attachment Multiple Well Plates Corning 3473 or 3471
BMP2 Noricum rhBMP-2 Dilute at 5 mg/ml in acetic acid 50 mM and store at 4 °C.
Thrombin Sigma T9010 Dilute in CaCl2 2%, 500 mL per vial, and store at 4 °C.
Fibrinogen Sigma F3879 Dilute at 4 mg/100 mL in PBS. Store at -20C. Warm before use.
Tissue-culture dishes 35 mm x 10 mm Falcon 353001
U-Botton 96 well plate Falcon 353077
NSG mice The Jackson Laboratory 5557 NSG mice were a kind gift from Dr Leonard Shultz (The Jackson Laboratory).
Chlorhexidine G9 Dilute 1:10 before use
Carprofen Pfizer Rimadyl 5 mg/g of mouse
Buprenorphine Alstoe Vetergesic 0.1 mg/g of mouse body weight
Isoflurane Abbott B506 Induction of anaesthesia 2%, maintenance 1%
Trimmer Wella Contura HS61
Surgical glue 3M Vetbond
carbomer (polyacrylic acid)  as Ophthalmic gel Novartis Viscotears Liquid Gel
Human Normal Immunoglobulin Gammaplex 10g vial 100 ml/mouse intravenously, 30 min before infusion of specific antibody.
NT-QTracker Invitrogen Q21021MP Vessel-pooling agent. Administrate 15 ml/mouse intravenously 5 min before imaging.
AF488-hCD45 Biolegend 304017 100 ml/mouse intravenously, 30 min before imaging.
FITC-hCD31 BD Pharmigen 555445 100 ml/mouse intravenously, 30 min before imaging.
Super glue Loctite  Super Glue
Micro-Drill Kit IDEAL – Fisher Scientific NC9010016
Microsurgical microscope No specific brand/company is adviced.
LSM 710 NLO Zeiss Upright confocal microscope with motorized stage, two-photon laser and 20x 1.0 NA water immersion lens. Alternatively, a microscope with similar specifications could be used.
MaiTai “High Performance” fully automated 1-box 517 mode-locked Ti:Sapphire laser with DeepSee dispersion compensation  Spectra-Physics
Formalin solution, neutral buffered, 10%  Sigma-Aldrich HT501128
Ethanol Sigma-Aldrich 32294
Osteosoft Millipore 1.01728.1000
Polysine slices Thermo scientific J2800AMNZ
Antigen unmasking solution Vector H-3300 Store at 4 °C. Dilute 1:100 in H2O for working solution.
Triton 100x Sigma-Aldrich T9284
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A96470 Store at 4 °C.
Normal Goat serum (NGS) Sigma-Aldrich G9023 Store at 4 °C.
Endomucin Antibody Santa Cruz sc-65495 Store at 4 °C.
hVimentin antibody Santa Cruz sc-6260 Store at 4 °C.
hCD31 antibody DAKO M0823 Store at 4 °C.
hCD45 antibody DAKO M0701 Store at 4 °C.
ADRP (Perilipin2) antibodies-online ABIN283918 Store at 4 °C.
Goat anti mouse secondary antibodies Invitrogen A11029 or A11005 Store at 4 °C.
Goat anti Rabbit secondary antibodies Invitrogen A11037 or A11008 Store at 4 °C.
Goat anti Rat secondary antibodies Invitrogen A11007 or A21247 Store at 4 °C.
Sudan Black Sigma S2380 Prepare a stock of 1% sudan black in ethanol 70%. Store at RT. Prepare working solution of 0.1% sudan black in ethanol 70% and filter using filter-paper before use.
DAPI Sigma D8417 Prepare stock in H20 at 100 mg/mg. Store at 4 °C.
Fluorescent mounting media Dako S3023 Add DAPI before use (1:400 from DAPI stock).
Cover glass VWR 631-0147
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoggatt, J., Kfoury, Y., Scadden, D. T. Hematopoietic Stem Cell Niche in Health and Disease. Annu Rev Pathol. 11, 555-581 (2016).
  2. Hanoun, M., et al. Acute myelogenous leukemia-induced sympathetic neuropathy promotes malignancy in an altered hematopoietic stem cell niche. Cell Stem Cell. 15 (3), 365-375 (2014).
  3. Frisch, B. J., et al. Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia. Blood. 119 (2), 540-550 (2012).
  4. Zhang, B., et al. Altered microenvironmental regulation of leukemic and normal stem cells in chronic myelogenous leukemia. Cancer Cell. 21 (4), 577-592 (2012).
  5. Schepers, K., et al. Myeloproliferative neoplasia remodels the endosteal bone marrow niche into a self-reinforcing leukemic niche. Cell Stem Cell. 13 (3), 285-299 (2013).
  6. Krause, D. S., et al. Differential regulation of myeloid leukemias by the bone marrow microenvironment. Nat Med. 19 (11), 1513-1517 (2013).
  7. Mendez-Ferrer, S., Scadden, D. T., Sanchez-Aguilera, A. Bone marrow stem cells: current and emerging concepts. Ann N Y Acad Sci. 1335, 32-44 (2015).
  8. Boulais, P. E., Frenette, P. S. Making sense of hematopoietic stem cell niches. Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).
  9. Ding, L., Morrison, S. J. Haematopoietic stem cells and early lymphoid progenitors occupy distinct bone marrow niches. Nature. 495 (7440), 231-235 (2013).
  10. Kunisaki, Y., et al. Arteriolar niches maintain haematopoietic stem cell quiescence. Nature. 502 (7473), 637-643 (2013).
  11. Pinho, S., et al. PDGFRalpha and CD51 mark human nestin+ sphere-forming mesenchymal stem cells capable of hematopoietic progenitor cell expansion. J Exp Med. 210 (7), 1351-1367 (2013).
  12. Mizoguchi, T., et al. Osterix marks distinct waves of primitive and definitive stromal progenitors during bone marrow development. Dev Cell. 29 (3), 340-349 (2014).
  13. Zhou, P., Wang, Y., Li, D., Hu, S. Y., Chen, G. H. Therapeutic efficacy of mixed hematopoietic stem cell transplantation for pediatric hematologic diseases. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 22 (2), 434-439 (2014).
  14. Sugiyama, T., Kohara, H., Noda, M., Nagasawa, T. Maintenance of the hematopoietic stem cell pool by CXCL12-CXCR4 chemokine signaling in bone marrow stromal cell niches. Immunity. 25 (6), 977-988 (2006).
  15. Tzeng, Y. S., et al. Loss of Cxcl12/Sdf-1 in adult mice decreases the quiescent state of hematopoietic stem/progenitor cells and alters the pattern of hematopoietic regeneration after myelosuppression. Blood. 117 (2), 429-439 (2011).
  16. Pearce, D. J., et al. AML engraftment in the NOD/SCID assay reflects the outcome of AML: implications for our understanding of the heterogeneity of AML. Blood. 107 (3), 1166-1173 (2006).
  17. Sanchez, P. V., et al. A robust xenotransplantation model for acute myeloid leukemia. Leukemia. 23 (11), 2109-2117 (2009).
  18. Uzan, B., et al. Interleukin-18 produced by bone marrow-derived stromal cells supports T-cell acute leukaemia progression. EMBO Mol Med. 6 (6), 821-834 (2014).
  19. Foster, K., et al. Different Motile Behaviors of Human Hematopoietic Stem versus Progenitor Cells at the Osteoblastic Niche. Stem Cell Reports. 5 (5), 690-701 (2015).
  20. Hawkins, E. D., et al. T-cell acute leukaemia exhibits dynamic interactions with bone marrow microenvironments. Nature. 538 (7626), 518-522 (2016).
  21. Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).
  22. Lassailly, F., Foster, K., Lopez-Onieva, L., Currie, E., Bonnet, D. Multimodal imaging reveals structural and functional heterogeneity in different bone marrow compartments: functional implications on hematopoietic stem cells. Blood. 122 (10), 1730-1740 (2013).
  23. Holzapfel, B. M., Wagner, F., Thibaudeau, L., Levesque, J. P., Hutmacher, D. W. Concise review: humanized models of tumor immunology in the 21st century: convergence of cancer research and tissue engineering. Stem Cells. 33 (6), 1696-1704 (2015).
  24. Scotti, C., et al. Engineering of a functional bone organ through endochondral ossification. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (10), 3997-4002 (2013).
  25. Scotti, C., et al. Recapitulation of endochondral bone formation using human adult mesenchymal stem cells as a paradigm for developmental engineering. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (16), 7251-7256 (2010).
  26. Kuznetsov, S. A., et al. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo. J Bone Miner Res. 12 (9), 1335-1347 (1997).
  27. Bianco, P., Robey, P. G. Skeletal stem cells. Development. 142 (6), 1023-1027 (2015).
  28. Vaiselbuh, S. R., Edelman, M., Lipton, J. M., Liu, J. M. Ectopic human mesenchymal stem cell-coated scaffolds in NOD/SCID mice: an in vivo model of the leukemia niche. Tissue Eng Part C Methods. 16 (6), 1523-1531 (2010).
  29. Groen, R. W., et al. Reconstructing the human hematopoietic niche in immunodeficient mice: opportunities for studying primary multiple myeloma. Blood. 120 (3), e9-e16 (2012).
  30. Chen, Y., et al. Human extramedullary bone marrow in mice: a novel in vivo model of genetically controlled hematopoietic microenvironment. Blood. 119 (21), 4971-4980 (2012).
  31. Reinisch, A., et al. A humanized bone marrow ossicle xenotransplantation model enables improved engraftment of healthy and leukemic human hematopoietic cells. Nat Med. 22 (7), 812-821 (2016).
  32. Sontakke, P., et al. Modeling BCR-ABL and MLL-AF9 leukemia in a human bone marrow-like scaffold-based xenograft model. Leukemia. 30 (10), 2064-2073 (2016).
  33. Theocharides, A. P., Rongvaux, A., Fritsch, K., Flavell, R. A., Manz, M. G. Humanized hemato-lymphoid system mice. Haematologica. 101 (1), 5-19 (2016).
  34. Antonelli, A., et al. Establishing human leukemia xenograft mouse models by implanting human bone marrow-like scaffold-based niches. Blood. 128 (25), 2949-2959 (2016).
  35. Holzapfel, B. M., et al. Tissue engineered humanized bone supports human hematopoiesis in vivo. Biomaterials. 61, 103-114 (2015).
  36. Reinisch, A., et al. Epigenetic and in vivo comparison of diverse MSC sources reveals an endochondral signature for human hematopoietic niche formation. Blood. 125 (2), 249-260 (2015).
  37. Lee, J., et al. Implantable microenvironments to attract hematopoietic stem/cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (48), 19638-19643 (2012).
  38. Lee, J., Heckl, D., Parekkadan, B. Multiple genetically engineered humanized microenvironments in a single mouse. Biomater Res. 20 (19), 1-13 (2016).
  39. Ho, M. S., Medcalf, R. L., Livesey, S. A., Traianedes, K. The dynamics of adult haematopoiesis in the bone and bone marrow environment. Br J Haematol. 170 (4), 472-486 (2015).
  40. Bersani, F., et al. Bioengineered implantable scaffolds as a tool to study stromal-derived factors in metastatic cancer models. Cancer Res. 74 (24), 7229-7238 (2014).
  41. Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 721-735 (2014).
  42. Holzapfel, B. M., et al. Species-specific homing mechanisms of human prostate cancer metastasis in tissue engineered bone. Biomaterials. 35 (13), 4108-4115 (2014).
  43. Thibaudeau, L., Holzapfel, B. M., Hutmacher, D. W. Humanized mice models for primary bone tumor and bone metastasis research. Cell Cycle. 14 (14), 2191-2192 (2015).
  44. Thibaudeau, L., et al. A tissue-engineered humanized xenograft model of human breast cancer metastasis to bone. Dis Model Mech. 7 (2), 299-309 (2014).
  45. Abarrategi, A., Foster, K., Hamilton, A., Mian, S., Passaro, D., Gribben, J., Mufti, G., Bonnet, D. Versatile humanized niche model enables study of normal and malignant human hematopoiesis. J Clin Invest. 127 (2), (2017).
  46. Abarrategi, A., et al. In vivo ectopic implantation model to assess human mesenchymal progenitor cell potential. Stem Cell Rev. 9 (6), 833-846 (2013).
  47. Rubio, R., et al. Bone environment is essential for osteosarcoma development from transformed mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32 (5), 1136-1148 (2014).
  48. Abarrategi, A., et al. Multiwall carbon nanotube scaffolds for tissue engineering purposes. Biomaterials. 29 (1), 94-102 (2008).
  49. Abarrategi, A., et al. Gene expression profile on chitosan/rhBMP-2 films: A novel osteoinductive coating for implantable materials. Acta Biomater. 5 (7), 2633-2646 (2009).
  50. Abarrategi, A., et al. Biological properties of solid free form designed ceramic scaffolds with BMP-2: in vitro and in vivo evaluation. PLoS One. 7 (3), e34117 (2012).
  51. Abarrategi, A., et al. Chitosan scaffolds for osteochondral tissue regeneration. J Biomed Mater Res A. 95 (4), 1132-1141 (2010).
  52. Abarrategi, A., et al. Improvement of porous beta-TCP scaffolds with rhBMP-2 chitosan carrier film for bone tissue application. Tissue Eng Part A. 14 (8), 1305-1319 (2008).
  53. Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. Phenotypic and functional characterization of endothelial colony forming cells derived from human umbilical cord blood. J Vis Exp. (62), (2012).
  54. JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy. J Vis Exp. , (2016).
  55. Hong, J. K., Yun, J., Kim, H., Kwon, S. Three-dimensional culture of mesenchymal stem cells. Tissue Eng Regen Med. 12 (4), 211-221 (2015).
  56. Bara, J. J., et al. Three-dimensional culture and characterization of mononuclear cells from human bone marrow. Cytotherapy. 17 (4), 458-472 (2015).
  57. Dong, H. W., Qin, S., Rafailovich, M., Ma, Y. Developing an Optimal Biofunctional Scaffold for Hematopoietic Stem Cell Quiescent Maintenance and Expansion. N Am J Med Sci. 8 (2), (2015).
  58. Raic, A., Rodling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
  59. Miyoshi, H., Morita, M., Ohshima, N., Sato, C. Expansion of mouse hematopoietic progenitor cells in three-dimensional cocultures on frozen-thawed stromal cell layers formed within porous scaffolds. Exp Hematol. 43 (2), 115-124 (2015).
  60. Cuddihy, M. J., Wang, Y., Machi, C., Bahng, J. H., Kotov, N. A. Replication of bone marrow differentiation niche: comparative evaluation of different three-dimensional matrices. Small. 9 (7), 1008-1015 (2013).
  61. Sharma, M. B., Limaye, L. S., Kale, V. P. Mimicking the functional hematopoietic stem cell niche in vitro: recapitulation of marrow physiology by hydrogel-based three-dimensional cultures of mesenchymal stromal cells. Haematologica. 97 (5), 651-660 (2012).
  62. Leisten, I., et al. 3D co-culture of hematopoietic stem and progenitor cells and mesenchymal stem cells in collagen scaffolds as a model of the hematopoietic niche. Biomaterials. 33 (6), 1736-1747 (2012).
  63. Ferreira, M. S., et al. Cord blood-hematopoietic stem cell expansion in 3D fibrin scaffolds with stromal support. Biomaterials. 33 (29), 6987-6997 (2012).
  64. Baldwin, J. G., et al. Periosteum tissue engineering in an orthotopic in vivo platform. Biomaterials. 121, 193-204 (2017).
  65. Rafii, S., Butler, J. M., Ding, B. S. Angiocrine functions of organ-specific endothelial cells. Nature. 529 (7586), 316-325 (2016).
  66. Seandel, M., et al. Generation of a functional and durable vascular niche by the adenoviral E4ORF1 gene. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (49), 19288-19293 (2008).
  67. Medyouf, H. The microenvironment in human myeloid malignancies: emerging concepts and therapeutic implications. Blood. 129 (12), 1617-1626 (2017).

Tags

BioengineeringHumanized Bone MarrowMicroenvironmentsMouseLive ImagingCell Carrier ScaffoldsHaematopoietic FieldBone Marrow NicheTumor MetastasisDrug ScreeningGelatin SpongeStromal CellsHaematopoietic CellsRecombinant Human Bone Morphogenetic ProteinThrombinFibrinogenSurgical Implantation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Passaro, D., Abarrategi, A., Foster, K., Ariza-McNaughton, L., Bonnet, D. Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging. J. Vis. Exp. (126), e55914, doi:10.3791/55914 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image