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Developmental Biology

Bioengineering von humanisierten Knochenmark-Mikroumgebungen in der Maus und ihre Visualisierung durch Live Imaging

Published: August 01, 2017
doi:
10.3791/55914
, , , ,
1Haematopoietic Stem Cell Laboratory,The Francis Crick Institute

Summary

Eine Methode zum Erstellen und Lebendigen von verschiedenen humanisierten Knochenmarknischen in Mäusen wird vorgestellt. Basierend auf der unterstützenden Nische, die durch menschliche mesenchymale Zellen erzeugt wird, induziert die Zugabe von menschlichen Endothelzellen die Bildung von menschlichen Gefäßen, während die Zugabe von rhBMP-2 die Bildung von menschlichem Maus-chimären reifen Knochengewebe induziert.

Abstract

Menschliche hämatopoetische Stammzellen (HSCs) befinden sich in der Knochenmark (BM) Nische, einem komplizierten, multifaktoriellen Netzwerk von Komponenten, die Zytokine, Wachstumsfaktoren und extrazelluläre Matrix produzieren. Die Fähigkeit der HSCs, ruhig zu bleiben, sich selbst zu erneuern oder zu differenzieren und Mutationen zu erlangen und bösartig zu werden, hängt von den komplexen Wechselwirkungen ab, die sie mit verschiedenen Stromkomponenten herstellen. Um das Übersprechen zwischen menschlichen HSCs und der menschlichen BM-Nische in physiologischen und pathologischen Zuständen zu beobachten, haben wir ein Protokoll entwickelt, um eine humanisierte BM-Nische in immundefizienten Mäusen zu ektopisch zu modellieren und darzustellen. Wir zeigen, dass die Verwendung verschiedener zellulärer Komponenten die Bildung von humanisierten Strukturen ermöglicht und die Möglichkeit hat, langfristige menschliche hämatopoetische Engagements aufrechtzuerhalten. Mit Hilfe der Zwei-Photonen-Mikroskopie können wir diese Strukturen in situ in der Einzelzell-Auflösung live darstellen und bieten ein leistungsfähiges neues Werkzeug für die funktionale Charakterisierung des menschlichen BM mIcroenvironment und ihre Rolle bei der Regulierung der normalen und malignen Hämatopoese.

Introduction

Zell-Schicksalsentscheidungen, die in Stammzell-Kompartimenten beobachtet werden, sind durch sowohl intrinsische als auch extrinsische Faktoren genau reguliert. Insbesondere ist es mittlerweile weithin anerkannt, dass die BM-Mikroumgebung eine wesentliche Rolle bei der Steuerung des Switches in HSCs von einem Ruhestand zu einem aktiven Staat sowie in ihrer Selbstverlängerung oder Differenzierung Schicksalsentscheidung spielt 1 . Darüber hinaus zeigen die jüngsten Erkenntnisse, dass hämatologische Malignome die Funktion der BM-Mikroumgebung beeinflussen und auf das Vorhandensein eines aktiven Übersprechens zwischen den beiden Kompartimenten 2 , 3 , 4 , 5 , 6 hinweisen. Trotz der jüngsten Fortschritte bleiben viele wichtige Fragen, wie die Aktivität bestimmter BM-Nischen-Komponenten zum HSC-Verhalten und zur bösartigen Transformation beiträgt.

Die BM-Mikroumgebung ist ein sehr heterog Enge und komplexe Mischung aus vielen verschiedenen Zelltypen, jeweils mit speziellen Funktionen. Die reichhaltige endotheliale (EC) und vaskuläre Komponente regelt den Nährstoff- und Metabolitumsatz, das Eindringen und Austreten verschiedener Zellen zu und von der BM und mehrere HSC-Funktionen 7 , 8 . Mesenchymale Stromazellen (MSCs), eine heterogene Population von undifferenzierten Stammzellen und Progenitoren, die durch drei verschiedene Linien ( dh osteogene, chondrogene, adipogene) begangen werden, sind ein weiterer wesentlicher Bestandteil der BM-Nische. Diese MSCs lokalisieren sowohl in zentralen Bereichen des BM als auch in der Nähe zum endostealen Gebiet. Sie können mit Gefäßstrukturen assoziiert sein und sind in die Regulierung der HSC-Funktion 9 , 10 , 11 , 12 , 13 ,"> 14 , 15 .

Viele Berichte deuten darauf hin, dass HSCs in verschiedenen definierten Standorten innerhalb des Marks wohnen und dass ihre Funktion von ihrer genauen Lokalisierung abhängen könnte. Die meisten der gegenwärtigen Kenntnisse über HSCs und ihre Interaktion mit der BM Mikroumgebung stammen aus murinen Studien 1 . Die Verwendung von Xenotransplantatmodellen hat dieses Wissen auf menschliche normale und maligne HSCs ausgedehnt, die innerhalb des murinen BM der immundefizienten Mäuse 16 , 17 , 18 , 19 , 20 ineinander greifen. Obwohl dies ein gültiges Modell darstellt, stellt es immer noch viele Herausforderungen dar, wie z. B. die Notwendigkeit, die Empfängermaus in den meisten Fällen zu bedingen, um die menschliche HSC-Referenzierung und die Verpflanzung oder die quer-artige Barriere und ihren schlecht verstandenen Einfluss auf Zell-Zell-Wechselwirkungen zu ermöglichen Funktionen.

Die Verwendung von neutralisierenden Antikörpern und genetisch modifizierten Mäusen, zusammen mit der Xenotransplantation, hat dazu beigetragen, den komplexen Dialog hervorzuheben, den die menschlichen HSCs mit ihren Mikroumgebungen herstellen. Die Einführung und Entwicklung der intravitalen Zwei-Photon-konfokalen Mikroskopie hat diese Studien einen Schritt nach vorn gemacht, was die direkte, hochauflösende und dynamische Abbildung des Knochenmarks 19 , 20 , 21 , 22 ermöglicht und ein leistungsfähiges Werkzeug für die Funktionalität bietet Charakterisierung der BM-Mikroumgebung und ihre Rolle bei der Regulierung der HSC-Funktion. Um einige der Probleme der klassischen Xenotransplantationsmodelle zu umgehen, wurde das Konzept der Technik einer humanisierten BM-Struktur in den Vordergrund gestellt. Durch die Zusammenführung von Biomaterialien und Zellimplantationskonzepten haben die Berichte die Machbarkeit des menschlichen Knochens m gezeigtPfeil-Mikroumgebung in heterotopen Gebieten 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Dies eröffnet die Möglichkeit, Biotechnologie in Mausmodellen zu verwenden, um menschliche normale und maligne Hämatopoese 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , Tumorentstehung und Metastase 40 , 41 , 42 zu untersuchen , 43 , 44 .

Basierend auf bisherigen Erfahrungen in der Knochengewebetechnik und in vivo Bildgebung 19 , 22 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 beschreiben wir ein Protokoll für Biotechniker und lebende Bildorganotypische menschliche BM Gewebe. Diese Strukturen stammen aus der Implantation von menschlichen BM-abgeleiteten Stromazellen in kollagenbasierte Gerüste, die subkutan in immundefizienten Mäusen gepfropft wurden. In einem früheren Bericht haben wir gezeigt , dass humane MSCs die Bildung eines menschlichen Mikro für die Verpflanzung von menschlichen hämatopoetischen Zellen 45 ausreichend sicherzustellen. Darüber hinaus beschreiben wir hier, wie die Co-Implantation anderer menschlicher BM-ZellkomponentenS, wie zB menschliche Endothelzellen (hEC) und / oder für die Knochenbildung wichtige Zytokine ( z. B. hBMP2), kooperieren mit hMSCs zur Erzeugung unterschiedlicher humanisierter Mikroumgebungen, die in situ lebensbildlich abbilden können.

Protocol

Alle Tierversuche wurden unter PPL 70/8904 durchgeführt, die vom UK Home Office und gemäß den Richtlinien von Cancer Research UK genehmigt wurden. Die Verwendung von menschlichen Nabelschnurblut (UCB) und primäre menschliche akute myeloische Leukämie (AML) Proben wurde von der East London Ethical Committee nach Erhalt der Zustimmung genehmigt und wurde in Übereinstimmung mit der Erklärung von Helsinki durchgeführt. 1. Bioengineering Kollagen-basierte Gerüste mit menschlichen hämatopoetischen und Strom-Zellen HINWEIS: Das gesamte Protokoll sollte in sterilen Bedingungen und mit sterilem Material durchgeführt werden. Zellkulturmedium 1 entspricht hMSC-Medium (MEM-α, P / S und 10% hMSC-FBS); Zellkulturmedium 2 entspricht dem EC-Medium (M199, 20% FBS, P / S, 10mM HEPES, 50 μg / ml Heparin, 2 mM Glutamin und 50 μg / mL EKGS) und Zellkulturmedium 3 entspricht hämatopoetischem Zellmedium (H5100 Und P / S). Nabelschnurblut vorbereiten mOnonukleäre Zellen (CB-MNCs) oder primäre AML (Knochenmark oder periphere Blut-MNCs) unter Verwendung eines Ficoll-Paque-Dichtegradienten gemäß den etablierten Protokollen 53 . Für AML, delete die T-Zellen mit OKT.3-Antikörper. Inkubieren Sie 4 μg OKT.3 pro 1 x 10 6 AML MNCs für 30 min bei Raumtemperatur, bevor Sie die Zellen in PBS waschen. Falls erforderlich, kryokonservieren die MNCs in FBS mit 10% DMSO bei 2 x 10 8 Zellen pro ml. Bereiten Sie hMSC (Kulturmedium 1) und EC (Kulturmedium 2) Zellkulturen vor. Plate hMSC-Zellen (siehe Tabelle der Materialien ) auf regulären Zellkulturflaschen im hMSC-Medium. Platten-ECs (siehe Tabelle der Materialien ) auf Kollagen-1-beschichteten Oberflächen in EC-Medium. Bei 85-90% Zellkonfluenz das Medium entfernen, zweimal mit PBS waschen und Trypsin-EDTA-Lösung (20 μl pro cm 2 ) hinzufügen. Nach 5 min ist zu prüfen, ob die Zellen abgelöst sind. Wiedergewinnung der Zellen durch Verdünnen von 1:3 mit Zellkulturmedium. Bei 300 xg für 5 min zentrifugieren und in dem entsprechenden Medium für jeden Zelltyp wieder suspendieren und die Zellen mit einer Neubauer-Kammer zählen. Verwenden Sie Zellen mit 2 x 10 6 – 10 7 Zellen pro ml. Wenn beide Zelltypen zusammen verwendet werden müssen, mischen Sie die hMSC- und EC-Suspensionen im 1: 1-Verhältnis. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine Insulinspritze. Mit einem Skalpell schneiden Sie das sterilisierte Gelatine-Schwamm ( zB Gelschaum) Anfangsgerüst (20 mm x 60 mm x 7 mm) in 24 Stück ähnlicher Größe (6,6 mm x 7,5 mm x 7 mm, Abbildung 1A und B ). Replizieren Sie Gelatinegerüste durch Eintauchen in PBS (5 min). Einer nach dem anderen legen Sie die Gerüste vorsichtig auf ein steriles Gewebe, um überschüssiges PBS zu entfernen. Übertragen Sie die Gerüste auf eine Vertiefung einer 24-Well-Platte (ultra-low-Befestigungsfläche) und verwenden Sie die Spritze, um 50 μl mit 10 5 – 10 6 Zellen (hMSC alEine oder in Kombination mit hEC; Fig. 1C ). Wiederholen Sie Schritt 1.7 mit jedem Gerüst, bis alle erforderlichen Gerüste mit Stromazellen ausgesät werden. Inkubieren für 1 h innerhalb eines Zellkulturinkubators (37 ° C und CO 2 5%). Füllen Sie jede Vertiefung mit 3 ml Zellkulturmedium 1 ( Abbildung 1D ) und geben Sie die Gerüste zu einem Zellkulturinkubator (37 ° C und CO 2 5%) für die Inkubation über Nacht zurück. Verwenden Sie Zellkulturmedium 2, wenn ECs in den Gerüsten verwendet werden. Tauen Sie CB-MNCs und isolieren Sie CD34 + Zellen von ihnen nach einem geeigneten CD34 + Abschnitt Kit Protokoll. Die ausgewählten CD34 + Zellen in Medium 3 suspendieren und in einer Neubauer Kammer zählen. HINWEIS: Hier wurden Zellen in einer Konzentration von 2 x 10 6 Zellen pro ml verwendet. Wenn AML-Patienten-abgeleitete Primärproben verwendet werden, auftauen die Zellen, verdünnen sie 1:10 in FBS, zentrifugieren sie für 5 min bei 300Xg, resuspendieren die Zellen in PBS-2% FBS, fügen Anti-Human-CD3-Antikörper (2 – 4 μg pro 10 6 Zellen) hinzu und inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min. 5 min bei 300 xg zentrifugieren und in hämatopoetischem Zellmedium, ergänzt mit Zytokinen (20 ng / ml Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (G-CSF), 20 ng / ml IL-3 und 20 ng / ml Thrombopoetin (TPO) . Wiederholen Sie die Schritte 1.7 – 1.9, aber in diesem Fall Saatgut 1 x 10 5 menschliche hämatopoetische Zellen anstelle von Stroma-Komponenten, wie oben. Füllen Sie die Vertiefung mit 3 ml Zellkulturmedium 3 ( Abbildung 1D ) und geben Sie die Gerüste in einen Zellkulturinkubator (37 ° C und CO 2 5%) für die Inkubation über Nacht zurück. Verwenden Sie eine 1: 1 Mischung aus Zellkulturmedien 2 und 3 Wenn ECs in den Gerüsten verwendet werden. Für nur rekombinante menschliche Knochen morphogenetische Protein-2 (rhBMP-2) Trägergerüste, sanft die Gerüste eins nach dem anderen auf ein steriles Gewebe, um überschüssiges P zu entfernenBS. Übertragen Sie die Gerüste auf eine Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen ( Abbildung 1E ) und fügen Sie 5 μl rhBMP-2 hinzu, wobei das Gerüst gründlich abdeckt. Füge 20 μl Thrombin hinzu, gefolgt von 20 μl Fibrinogen, wobei das Gerüst jedes Mal gründlich abgedeckt ist ( Abbildung 1F ). Wiederholen Sie den Vorgang für jedes Gerüst, bis alle erforderlichen Gerüste behandelt werden und dann für 5 – 10 min bei 37 ° C inkubieren. Prüfen Sie, ob sich die Koagulation erfolgreich gebildet hat. 2. Chirurgische Implantation von Biotechnischen Gerüsten HINWEIS: Hier wurden entweder männliche oder weibliche, 6- bis 12-wöchige NSG-Mäuse verwendet. Da die Tiere immundefizient sind, sollten alle Verfahren in sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Die Schritte 2.10 – 2.13 beziehen sich auf Überlebensstrategien und postoperative Versorgung. 60 – 120 min vor der Operation, subkutan verabreichen Schmerzmittel (Carprofen, 5 mg / kg Körpergewicht / Maus). Anästhesie in einer Kammer mit 0,5% Isofluran und 2 l / min O 2 induzieren. Die Mäuse sollten während des Eingriffs kontinuierlich überwacht werden. Übertragen Sie das Tier in den chirurgischen Bereich in anfälliger Position, um einen leichten Zugang zum Rücken zu haben. Halten Sie das Tier unter Anästhesie mit einem Nasenkonus, der 1,5% Isofluran und 2 L / min O 2 liefert. Halten Sie die Maus während des chirurgischen Eingriffs unter Anästhesie und überprüfen Sie häufig den Tierzustand. Während es unter Anästhesie ist, verwenden Sie ophthalmisches Gel auf den Augen der Maus, um Trockenheit zu verhindern, und halten Sie die Maus bei 37 ° C. Rasieren Sie den chirurgischen Bereich auf der Rückseite der Maus mit einem elektrischen Trimmer. Zur Sterilisation der Haut tauchen Sie eine Baumwollspitze in verdünntem Clorexidin ein (verdünnt 1:10 in PBS) und verwenden Sie diese Spitze, um die Hautoberfläche zu reinigen. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal. Mit sterilen Pinzetten und einem Skalpell (oder Schere), machen eine 0,5 bis 0,7 cm anterior-to-posterior volle Inzision der Haut. Verwenden Sie die Pinzette eingefügtUnter dem subkutanen Gewebe, um eine Tasche zu machen. Setzen Sie das Gerüst subkutan ein und achten Sie darauf, dass es tief in die Tasche gelegt wird ( Abbildung 1G und H ). Schließen Sie den Schnitt mit chirurgischem Kleber ( Abbildung 1I und J ). Zur Behandlung von postoperativen Schmerzen, subkutan verabreichen Buprenorphin (0,1 mg / kg Körpergewicht). Während der Erholung, legen Sie das Tier auf seine Seite in einem vorgewärmten Käfig und Monitor Erholung, bis normales Verhalten beobachtet wird. Verdünnen Sie Schmerzmittel im Wasser (Carprofen, 0,1 mg / ml Wasser) und stellen Sie es den Tieren als Trinkwasser für 4 Tage nach der Operation zur Verfügung. Überprüfen Sie das Tier und die Wunde häufig während der 48-h-post-chirurgie Zeitraum für mögliche nachteilige Effekte. 3. Mäusebehandlungen, Euthanasie und Probenentnahme für die Bildgebung HINWEIS: Die Analyse der Gerüste erfolgt zwischen8 und 24 Wochen nach der Implantation. 60 min vor der Bildgebung halten die implantierte Maus in einer Heizbox bei 37 ° C warm und intravenös 100 μl menschliches Immunglobulin verabreichen, um unspezifische Stellen zu blockieren. 30 min vor der Bildgebung intravenös verabreichen 10 μg (pro Maus) von spezifischen Antikörpern, um die interessierenden Zellen zu markieren. 5 min vor der Bildgebung intravenös 15 μl (verdünnt in 100 μl PBS) von 655 nm fluorophor-markiertem, Gefäß-Pooling-Mittel (655-VPA) verabreichen, um Gefäßstrukturen zu visualisieren. Euthanize die Maus über zervikale Versetzung. Mit scharfen Scheren, machen eine Längshaut Schnitt auf der Rückseite der Maus, in der Nähe der ursprünglichen Implantation Website. Mit Hilfe von Pinzetten und Scheren trennen Sie die Haut sorgfältig von der subkutanen Tasche, wo das Gerüst implantiert wurde. Halten Sie das Gerüst mit Pinzette und putzen Sie es vorsichtig von der Haut, indem Sie die Restmembran a schneidenNd Gewebe um das Gerüst mit Schere. Siehe Beispiele von Gerüsten, die in Abbildung 2 wiederhergestellt werden sollen. Sichern Sie das Gerüst mit schnell wirkendem Klebstoff auf eine Bilderzeugungsplatte (35 mm x 10 mm Petrischale) und füllen Sie mit Kochsalzlösung (PBS) bei Raumtemperatur. Für BMP-Gerüste, bevor Sie die Platte mit PBS füllen, verwenden Sie einen chirurgischen Mikrobohrer, um die Knochenoberfläche unter einem mikrochirurgischen Mikroskop zu verdünnen; Dies ermöglicht eine Fluorophor-Visualisierung und eine hochauflösende Bildaufnahme. Benutzen Sie entweder die 1,2- oder 1,6-mm-Grate, je nach Größe des Gerüsts. HINWEIS: Der Benutzer wird erkennen, wie viel zu bohren, abhängig von der Dicke des Knochens. Im Allgemeinen, da die BMP-Gerüste vaskularisiert sind, wird der Knochen etwas Farbe ändern und bei der Annäherung an die richtige Dicke für die Bildgebung roter werden. Legen Sie die Platte auf die Bühne des konfokalen Mikroskops. 4. Live-Imaging mit Zwei-Photonen-MicroscOpy HINWEIS: Bei Verwendung von nicht abgetasteten Detektoren (NDD) verwenden Sie immer den NDD-Schieberegler für die Bildgebung, um die Fluoreszenz an die NDD zu leiten. Die Mikroskopkonfiguration ist in Fig. 3 dargestellt . Schalten Sie das Mikroskop und den Computer ein, starten Sie die Software, indem Sie auf "System starten" klicken und zum Modus "Erfassung" wechseln. Markieren Sie das Feld "Manuelle Werkzeuge anzeigen". Im "Laser" -Menü schalten Sie den Zwei-Photonen-Laser ein und lassen ihn aufwärmen und stabilisieren. Im Menü "Imaging Setup" aktivieren Sie gleichzeitig "Channel Mode" und "Track Track jedes Frame". Im "Light Path" -Menü wählen Sie "Non Descanned" und "Main Beam Splitter MBS 760+". Ticken, um die vier NDDs zu aktivieren und die Konfiguration wie in Abbildung 3 dargestellt zu setzen . HINWEIS: Bei dieser Konfiguration wird das Kollagensignal aus Knochenstrukturen (SekOnd harmonische Erzeugung, SHG) wird bei 380 – 485 nm, FITC-hCD31 + menschlichen Endothelzellen und AF488-hCD45 + menschlichen hämatopoetischen Zellen bei 500-550 nm und 655-VPA bei 640 – 690 nm gesammelt. Im Menü "Kanäle" die "Laserwellenlänge" auf 890 nm und die Leistung auf 50% einstellen. Setzen Sie den "Gain (Master)" auf 500-600, den "Digital Offset" auf 0 und den "Digital Gain" auf 15 für jeden Kanal. Passen Sie diese Werte an, sobald die Erfassung begonnen hat. Im "Acquisition Mode" richten Sie die erforderlichen Parameter ein, um hochauflösende Bilder zu erhalten, ohne das Gewebe zu beschädigen und die Fluorophore zu bleichen. Stellen Sie "Scan-Modus" auf "Frame", "Frame Size" auf "x512 y512", "Line Step" auf 1, "Speed" auf 9, "Mittelwertbildung" auf 8, "Bit Tiefe" auf "8 Bit", " Modus "zu" Linie "," Richtung "zu" bidirektional "und" Methode "zu" bedeuten ". Setz das "ZoOm "auf 1 für den anfänglichen Scan des Bildes, und erhöhen Sie es, wenn nötig, um auf bestimmte Bereiche zu konzentrieren. Legen Sie die Platte mit dem Gerüst auf die Mikroskopstufe unter der 20X, 1,0 NA Wasser-Immersionslinse und senken Sie das Objektiv, bis es die Kochsalzlösung berührt. Setzen Sie den Fokus des Objektivs auf das Gerüst mit den Mikroskop-Okularen, mit einer Lampe als Lichtquelle. Aktiviere das "Z-Stack" -Menü, wähle die Funktion "First / Last" und setze das erforderliche Intervall zwischen zwei aufeinanderfolgenden Slices ( zB 2-μm Z-Stack). Halten Sie die Intervalle im Z-Stack konstant. Wählen Sie "Live", um einen Live-Scan des Samples abzubilden und die "Digital Gain" und "Digital Offset" für eine optimale Belichtung einzustellen. Um mehrere Kanäle gleichzeitig zu visualisieren, wählen Sie die Funktion "Split". Im "Stage" -Menü, während im "Live" -Modus, scannen Sie das Bild und "Mark" Regionen von interEst (ROI), wie die Lage von menschlichen hämatopoetischen Zellen und Gefäßstrukturen. Wenn der Scan der Probe abgeschlossen ist, wechseln Sie zum ersten ROI, um die Bildgebung zu starten. Im "Live" -Modus stellen Sie oben und unten den 3D-Z-Stack ein, der den interessierenden Bereich mit den Funktionen "Set first" und "Set last" umgibt. Sobald Sie fertig sind, stellen Sie das Zentrum, "C." Starten Sie die Erfassung des ROI mit der Schaltfläche "Start Experiment". Siehe Beispiele für Bilder in Fig. 4 , Fig. 5 und Fig. 6 . Sobald die Aufnahme abgeschlossen ist, speichern Sie das Bild im angegebenen Ordner. Gehe zum nächsten ROI und wiederhole Schritt 4.10. Sobald das Experiment abgeschlossen ist, entfernen Sie die Bilderzeugungsplatte aus dem Mikroskop, trennen Sie sorgfältig die Probe von der Platte und reinigen Sie den Restkleber. Bereiten Sie die Probe für die nächste Analysetechnik vor. 5. ProbenverarbeitungG für Histologie und Immunfärbung HINWEIS: Die Proben werden verarbeitet , entsprechend dem Protokoll in den allgemeinen Techniken Labor JoVE beschriebenen 54 beschreibt Probenfixierung, Einbetten und Prozesse sectioning. Knochenbildende Proben sollten für 7 Tage in einem EDTA-basierten Entkalkungsmittel zwischen den Fixierungs- und Einbettungsprozessen behandelt werden. Die Blockierungs- / Permeabilisierungslösung beträgt 10 mM PBS pH 7,4 Puffer mit 1% Triton X-100, 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 10% normales Ziegenserum (NGS). Setzen Sie die Scheiben in Xylol für 10 min), Xylol für 5 min, 100% iges Ethanol für 5 min, 70% iges Ethanol für 5 min, 50% iges Ethanol für 5 min und H 2 O für 5 min. Übertragen Sie die Scheiben auf eine Citrat-basierte Antigen-Entlarvung Arbeitslösung. Die Scheiben 15 Minuten lang kochen lassen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Die Scheiben in 10 mM PBS pH 7,4 Lösung mit 1% Triton X-100 (5 min, 3 mal) waschen. Übertragen Sie den samPles zur Blockierungs- / Permeabilisierungslösung und inkubieren für 30 min. Primärer Antikörper, der in Blockierungs- / Permeabilisierungslösung verdünnt ist, zugeben und über Nacht bei 4 ° C inkubieren. Die Scheiben in 10 mM PBS pH 7,4 Lösung mit 1% Triton X-100 (5 min, 3 mal) waschen. Sekundär-Antikörper, verdünnt in Blockierungs- / Permeabilisierungslösung, für 1 h im Dunkeln bei Raumtemperatur verdünnen. Waschen mit H 2 O (5 min, 3 mal). Um die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren, tauchen Sie die Scheiben in Sudan Black Arbeitslösung für 10 min, im Dunkeln und bei Raumtemperatur ein. Die Scheiben in H 2 O (5 min, 3 mal) waschen. Montieren Sie die Scheiben mit fluoreszierendem Montagemedium mit DAPI (0,5 μg / ml). Die Scheiben bei 4 ° C aufbewahren und darauf achten, dass das Montagemedium vor der Durchführung einer fluoreszierenden Bildgebung trocken ist. Siehe Beispielbilder in Abbildung 7 .

Representative Results

In Fig. 1 sind repräsentative Bilder der Gerüstzellseeding- und Implantationsprozesse gezeigt. In Abbildung 1C ist zu beachten, dass Zellen direkt in das Gerüst injiziert werden. In Abbildung 1G ist zu beachten, dass ein Einschnitt in der Rückseite der Maus erfolgt, wo die subkutane Tasche erstellt und das Gerüst implantiert wird. Abbildung 2 zeigt die Brutto-Morphologie von verschiedenen Gerüsten, die in NSG-Mäusen implantiert und nach 8 Wochen abgerufen wurden. Beachten Sie die leichte Vaskularisierung in hMSC-Saatgerüsten ( Abbildung 2A ). Die Co-Seeding von humanen ECs mit hMSCs im Gerüst ermöglicht die Bildung von relevanteren Gefäßen in Gerüsten ( Abbildung 2B ). Schließlich induziert die Anwesenheit von rhBMP-2 die Knochenbildung. Die abgerufelten Gerüste sind in diesem Fall größer, und sie sind konstituiertKnochen-ähnliches Hartgewebe Abbildung 3 zeigt den Kanalkonfigurationsaufbau am Mikroskop zur Live-Imaging mit NDD (Details in der Figurenlegende). Abbildung 4 und Video 1 zeigen menschliche hämatopoetische Zellen in hMSC-beschichteten Gerüsten. Gerüste wurden 8 Wochen nach der Implantation und nach der intravenösen Inokulation von AF488-hCD45-Antikörper und 655-VPA explantiert. Diese Vorgehensweise ermöglicht die Visualisierung von implantierten menschlichen hämatopoetischen Zellen und die Gefäßstruktur durch zwei-Photon-konfokale Mikroskopie. In diesem Fall zeigen die Bilder Blutgefäße (655-VPA) in Gerüsten und die langfristige Verpflanzung von humanen hämatopoetischen Zellen (AF488-hCD45) im Gerüstparenchym. Abbildung 5 und Video 2 entsprechen menschlichen Gerüsten, die mit hECs und hMSCs seeded sind. 8 Wochen nach der Operation wurden Gerüste nach dem intraven explantiertDie Inokulation von FITC-hCD31-Antikörper und 655-VPA, und die Bilder wurden mit einem zwei-Photonen-konfokalen Mikroskop, wie zuvor erwähnt, aufgenommen. Bilder zeigen die Teilnahme von hECs in der Gefäßbildung im Gerüst, was zu einem murine-menschlichen chimären Gefäßsystem führt. Fig. 6A zeigt repräsentative Daten des Ansatzes, der verwendet wird, um die Knochenbildung in MSC-Gerüsten zu stimulieren. Ähnlich wie bei den vorangegangenen Figuren, 8 Wochen nach der Implantation, wurde die intravenöse Inokulation von 655-VPA durchgeführt, Gerüste wurden abgerufen und Bilder wurden mit zweifach-konfokaler Mikroskopie aufgenommen. RhBMP-2-stimulierte Gerüste induzieren die Bildung von Knochengewebe, die aufgrund der SHG (Cyan-Farbe in den Bildern), die durch das Kalzium im Knochen bereitgestellt wurde, sichtbar gemacht werden konnten. Die dargestellten Bilder zeigen auch die Bildung von Hohlräumen und vaskularisiertem Endostealgewebe, die dem BM-Endostealgewebe sehr ähnlich sind. In Fig. 6B </sTrong> und Video 3 , hECs wurden mit hMSCs co-implantiert. Gerüste wurden nach der intravenösen Inokulation von FITC-hCD31-Antikörper und 655-VPA abgerufen, und zwei-Photon-konfokale Mikroskopiebilder zeigen die Beteiligung von hECs an der Neovaskularisation in einem knochenbildenden Gerüst. Fig. 7 zeigt repräsentative Bilder der Histologie, eine Prozedur, die durchgeführt wird, um die zuvor beschriebenen Ergebnisse zu bestätigen. Immunfluoreszenzbilder zeigen die Mausvaskulatur, hECs, hMSCs und Langzeit-engrafierte menschliche hämatopoetische Zellen in den Gerüststrukturen. Gerüste, die aus Mäusen gewonnen wurden, wurden fixiert und für die Immunfluoreszenz verwendet. In den rhBMP-2 Träger Knochen-bildenden Gerüsten ( Abbildung 7D- F ), beachten Sie die Morphologie des Gewebes, ähnlich reifes Knochenmark mit Fettgewebe. In diesem knochenbildenden Gerüst zeigen wir, dass hMSCs Fibroblasten sind, die t zeigen würdenHut tragen sie zu neugebildetem Gewebe als Stromazellen bei. Wir zeigen auch die menschliche Adipozytenmarker-Expression, die darauf hindeuten würde, dass hMSCs auch zur Fettgewebebildung beitragen. Abbildung 1. Repräsentative Bilder der Zellseeding- und Implantationsprozesse. A) Erstgerüst und Schneidverfahren mit Skalpell. B) 24 Stück aus dem ersten Gerüst erhalten. C) Gerüst-Zell-Seeding-Methode mit einer Spritze. D) zellgesetzte Gerüste mit Kulturmedium, bereit, implantiert zu werden. EF) Spezielle Schritte für knochenbildende Gerüste: E) Gerüst, das auf eine 96-Well-U-Bodenplatte und F) repräsentatives Bild des Verfahrens verwandelt wird, das verwendet wird, um rhBMP2, Thrombin und Fibrinogen dem Gerüst hinzuzufügen. GJ) Surgi Cal-Implantationsprozess unter Vollnarkose: G) in der Haut- und Gerüstimplantation entstandene Wunde, H) Implantationsverfahren und IJ) Wundschließverfahren mit chirurgischem Leim. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 2. Verschiedene Gerüste, die von Mäusen abgerufen wurden. Repräsentative Bilder von MSC Gerüsten (links), MSC + EC Gerüste (Mitte) und MSC + EC + BMP Gerüste (rechts). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 4 / 55914fig3.jpg "/> Abbildung 3. Kanalkonfiguration. Der Mikroskop-Filter-Setup wird angezeigt. A) Es gibt vier NDD-Detektormodule: Im ersten Modul gibt es zwei Filterwürfel; Das zweite und das dritte Modul haben jeweils einen Filterwürfel; Und das letzte Modul hat keinen Würfel (nicht benutzt). Die erste Photovervielfacherröhre (PMT) ist für den weit-roten Kanal (640 – 690 nm), der die unteren Wellenlängen reflektiert; Die folgenden sind 380 – 485 nm, 500 – 550 nm und 555 – 625 nm (die Reihenfolge ist immer von der niedrigeren zu höheren Wellenlängen). B) Die Fluorophor-Emissionen, die mit den obigen Konfigurationen (farbcodiert) nachweisbar sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 4. MSC Gerüst S Erlauben Sie die Bildung einer Nische für menschliche Hämatopoetische Zellen. A) und B) 3D-Rekonstruktionen von nach der Explantation entnommenen Z-Stacks nach intravenöser Inokulation mit AF488-hCD45 (grün) zur Markierung von humanen hämatopoetischen Zellen und 655-VPA (Magenta) m zur Markierung von Vaskulatur. Maßstäbe repräsentieren 20 μm in A und B (obere Platten) und 5 μm in B (untere Platten). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Video 1. MSC Gerüste erlauben die Bildung einer Nische für menschliche hämatopoetische Zellen . 3D-Rekonstruktion von humanen hämatopoetischen Zellen (AF488-hCD45), die mit dem Vaskulatur (655-VPA) im MSC-Gerüst (Kollagenstrukturen: SHG, Cyan) assoziiert sind. Jeder Stapel misst 140 x 140 μm.Ef = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video1.mov" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. (Klicken Sie mit der rechten Maustaste zum Herunterladen.) Abbildung 5. Menschliche ECs beteiligen sich an der Bildung von humanisierten Schiffen in MSC-Gerüsten. 3D-Rekonstruktion von Vaskulatur (655-VPA), die von ECs menschlichen Ursprungs (FITC-hCD31) in MSC + EC-Gerüsten ausgekleidet ist. Maßstäbe repräsentieren 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Video 2. Menschliche ECs beteiligen sich an der Bildung von humanisierten Schiffen in MSC-Gerüsten. 3D-Rekonstruktion von menschlichen ECs (FITC-hCD31) Auskleiden der va Sculatur (655-VPA) in MSC + EC Gerüsten. Jeder Stapel misst 240 x 240 μm. Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. (Klicken Sie mit der rechten Maustaste zum Herunterladen.) Abbildung 6. rhBMP-2 Carrier Gerüste haben Bone Surfaces und Humanized Vasculature Ähnlich wie die Knochenmark. A) 3D-Rekonstruktion von MSC + BMP-Gerüsten, die die Bildung von Knochenstrukturen (SHG-Cyan) und Vaskulatur (655-VPA) zeigen. Maßstäbe repräsentieren 100 μm (links), 70 μm (Mitte) und 50 μm (rechts). B) 3D-Rekonstruktion von MSC + EC + BMP-Gerüsten mit humanisierten Gefäßen (655-VPA), die mit menschlichen ECs (FITC-hCD31) ausgekleidet sind. Maßstäbe repräsentieren 50 μm (links) und 30 μm (Mitte und rechts).14 / 55914fig6large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Video 3. rhBMP-2 Carrier Gerüste haben Bone Surfaces und Humanized Vasculature Ähnlich wie die Knochenmark. 3D Rekonstruktion von MSC + VERA + BMP Gerüst (Knochen: SHG, Gefäße: 655-VPA, menschliche ECs: FITC-hCD31). Jeder Stapel misst 600 x 600 μm. Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. (Klicken Sie mit der rechten Maustaste zum Herunterladen.) Abbildung 7. Repräsentative Bilder der Immunfluoreszenz, die auf festen Gerüsten durchgeführt werden. AF) Immunfluoreszenzstudien durchgeführt, um menschliche Zellen zu lokalisieren, die implantiert wurdenN Gerüste AC) Gerüste, die mit hECs, hMSCs und hHSCs implantiert wurden. DF) Knochenbildende Gerüste implantiert mit hECs, hMSCs und hHSCs. Die Farbkanäle sind wie folgt: AD) menschliche EC (hCD31) und Maus-Gefäßstruktur (Endomucin, ENDOM), BE) hMSCs (hVimentin, hVIM) und Maus-Gefäßzellen (Endomucin, ENDOM), C) menschliche hämatopoetische Zellen (hCD45) Und Maus-Vaskulatur (Endomucin, ENDOM) und F) menschliches adiposes differenzierungsbezogenes Protein (hADRP) und Mausgefäße (Endomucin, ENDOM). Maßstäbe stellen 10 μm (A und C), 20 μm (B und E) und 40 (D und F) μm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Bedeutung im Hinblick auf bestehende Methoden:

In diesem Protokoll haben wir eine Methode beschrieben, um verschiedene humanisierte Mikroumgebungen bei Mäusen zu erzeugen und ihre Architektur über Zwei-Photonen-Mikroskopie und Histologie zu visualisieren. Die repräsentativen Daten liefern die Durchführbarkeit des Ansatzes, wobei verschiedene Stromazellen verwendet werden, um humanisierte Gewebe zu entwickeln. Das Protokoll hat spezifische Anwendungen für die Untersuchung von menschlichen hämatopoetischen Zellen und Knochenmark Nischen-abgeleiteten Zellen in normalen und pathologischen Bedingungen. Diese Anwendungen umfassen das Studium der klonalen Evolution, Drogen-Screening und Übersprechen zwischen menschlichen HSCs und Stroma-Komponenten. Im aufstrebenden Bereich der Tissue Engineering wurden mehrere alternative Ansätze vorgeschlagen. Ansätze der Notiz sind die Entwicklung von 3D humanisierten BM-Strukturen in vitro 55 , 56 , 57 ,S = "xref"> 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 und das orthotopische Transplantat von humanisierten BM-Gerüsten bei Mäusen 64 . Unser Ansatz hat den Vorteil, sowohl die Komplexität des In-vivo- Systems mit der einfachen anatomischen Zugänglichkeit des humanisierten Gewebetransplantats zu kombinieren.

Änderungen und Fehlersuche:

Eine Quelle der Variabilität in diesem Protokoll kann in der Auswahl der Zellen gefunden werden, die verwendet werden, um die Gerüste zu säen. In unserer Arbeit haben wir BM-abgeleitete hMSCs verwendet. Allerdings können mesenchymale Zellen aus mehreren Geweben gewonnen werden, die je nach Herkunft charakteristische Eigenschaften aufweisen können. Daher kann die Verwendung von hMSCs, die von verschiedenen Organen abgeleitet werden, berücksichtigt werden. Allerdings sollte ihre Fähigkeit, Knochengewebe in vivo zu bilden, vor der Verwendung in diesem p getestet werdenRotocol.This-Protokoll verwendet eine kommerziell erhältliche menschliche Endothelzellenquelle ( dh E4ORF1-transduzierte HUVEC). In jüngster Zeit wurde die Verwendung von organspezifischen Endothelzellen für verschiedene Zwecke mit 65 , 66 beschrieben . Darüber hinaus könnte die Verwendung von primären hECs, die aus dem BM abgeleitet wurden, eine interessante Verbesserung des Protokolls darstellen. Daher kann die Verwendung verschiedener Quellen von Endothelzellen unterschiedliche in vivo- Ergebnisse hervorrufen.

Wir nutzten NSG-immunkompromittierte Empfängermäuse, um die Implantation von humanisierten Gerüsten zu begünstigen und Gewebeabstoßung zu vermeiden. Wir schließen die Möglichkeit nicht aus, dieses Protokoll zu verwenden, um ektopische Knochenmarkgewebe in anderen Mausstämmen zu entwickeln. In der Tat kann rhBMP-2 die Knochenbildung in verschiedenen Säugetiermodellen 47 , 48 , 49 , 50 induzieren <sup>, 52 Allerdings sind Unterschiede in der Zelllebensfähigkeit und Langzeit-Transplantation wahrscheinlich mit verschiedenen Stämmen / Modellen beobachtet werden.

Das Timing der Gerüstwiederherstellung kann auch flexibel sein, je nach dem Zweck des Experiments. In dem vorgestellten Protokoll erholen wir Proben bei 8 – 12 Wochen nach der Implantation, um die langfristige hämatopoetische Verpflanzung zu beurteilen. Um frühe Schritte der menschlichen BM-Nischenbildung ( zB osteochondrale Gewebebildung 47 oder vaskuläre Entwicklung) zu untersuchen, können verschiedene Zeitpunkte gewählt werden.

Die in diesem Protokoll beschriebene Live-Imaging-Technik ist für die kurzzeitige Bildgebung von Explantaten indiziert. Die Verwendung einer äquilibrierten Kammer zur Aufrechterhaltung der physiologischen Temperatur, der Sauerstoffspannung und der CO 2 -Konzentration sollte bei Langzeitabbildungen berücksichtigt werden, um das Motilitätsverhalten zu untersuchen.

Kritische StEps innerhalb des Protokolls:

Unter den Herausforderungen, die mit dem Protokoll zusammenhängen, würden wir die technischen Fähigkeiten hervorheben, die für einige Schritte erforderlich sind. Mesenchymale und endotheliale Zellen sollten bei niedrigen Zelldurchgangszahlen verwendet werden; Andernfalls werden sie nicht in der Lage sein, die menschliche hämatopoetische Zellentransplantation in vivo zu unterstützen oder an der novo vasculature und Knochenbildung in vivo teilzunehmen. Wir empfehlen die Verwendung von hMSCs und hECs an den Passagen 1 – 5. Gerüstvorbereitung und Zellseeding Schritte erfordern grundlegende Zellkulturfähigkeiten und Kenntnisse über die Eigenschaften der spezifischen Zellen, die in der Prozedur verwendet werden. Das Chirurgie-Protokoll ist ganz einfach, aber erfordert etwas Übung. Die Aufrechterhaltung einer aseptischen Umgebung zur Vermeidung einer Kontamination der implantierten Gerüste in immundefizienten Mäusen ist entscheidend für den Erfolg des Experiments. Beispiel-Explantat und Live-Bildgebung erfordern chirurgische Praxis (vor allem für den Einsatz des Mikrobohrers) und Kenntnisse derMikroskopsystem. Schließlich erfordern die Probenverarbeitung und die Histologie Grundkenntnisse über die zu verwendenden Techniken.

Einschränkungen der Technik:

Der Ansatz, den wir beschreiben, ermöglicht die Visualisierung von lebenden menschlichen hämatopoetischen Zellen, die eine humanisierte Knochenmark-Mikroumgebung säen, wobei menschliche Endothelzellen vaskuläre Strukturen bilden und mesenchymale Zellen Knochen / Knochenmark bilden. Da das Gewebe in vivo gebildet wird , wird das fertiggestellte Gerüst noch chimär (menschlich und murine). Diese Frage sollte berücksichtigt werden, da das chimäre Gewebe die menschliche Knochenmarkskomplexität und -umgebung nicht vollständig imitieren kann.

Die implantierten Gerüste haben eine begrenzte Größe (wir haben ein Maximum von 6,6 x 7,5 x 7 mm ausprobiert) und sind daher in der Lage, eine begrenzte Anzahl von Zellen für die Xenotransplantation zu bewirten. Die absolute Anzahl der zurückgewonnenen Zellen ist ebenfalls begrenzt; So sollte die Anzahl der implantierten GerüsteAls Funktion der Anzahl der für das Experiment benötigten Zellen berechnet werden.

Die von uns beschriebene bildgebende Anwendung ist besonders nützlich für die Beobachtung großer Flächen von lebendem Gewebe in Tiefen von 150-200 μm von der Oberfläche, ohne die Architektur zu stören und die Zellen zu beschädigen. Daher erlaubt es nicht die Visualisierung des ganzen Gerüstes. Wenn ein vollständiger Scan des Gewebes erforderlich ist, wären Standard-Immunfluoreszenz-Ansätze geeigneter.

Zukünftige Anwendungen:

Die zukünftige Ausrichtung dieses biotechnischen Modells wäre, die Komplexität der menschlichen Komponenten im Gewebe zu erhöhen. Das Wissen und die Charakterisierung des menschlichen BM Nische hat in den letzten Jahren Fortschritte gemacht 67 und das beschriebene Protokoll könnte eine interessante Plattform , um die Funktion dieser neuen zellulären Komponenten und löslichen Faktoren, sowie ihre Rolle bei der Unterstützung normal / verleumden zu studieren seinAmeisen HSCs.

Darüber hinaus bietet die bildgebende Technik das Potenzial für die intravitale Bildgebung der Gerüste in Längsschnittstudien, die technische Verbesserungen bei der Bildgebung der Gerüste in lebenden, anästhesierten Mäusen mit Nachkriegsrückgewinnung erfordern würden. Dieser Ansatz würde zusätzliche Schritte erfordern und wird derzeit im Labor untersucht.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken den Mitarbeitern in den Core-Einrichtungen des Francis Crick Institute (Biological Research, In Vivo Imaging und Experimental Histopathology) und Yolanda Saavedra-Torres und Mercedes Sanchez-Garzon, die Tierärzte von Crick und LRI für ihre wertvolle Hilfe. Wir danken Dr. W. Grey für das kritische Lesen des Manuskripts. DP wurde von einem nicht-klinischen Forschungsstipendium der EHA unterstützt. Diese Arbeit wurde von dem Francis Crick Institute unterstützt, das seine Kernfinanzierung von Cancer Research UK (FC001045), dem UK Medical Research Council (FC001045) und dem Welcome Trust (FC001045) erhält.

Materials

Ficoll-Paque Ge Healthcare 17-1440-03
Cd34 positive selection Kit Stemcell 18056 Store a 4°C.
Magnet Stemcell 18000
Anti-human CD3 antibody, clone OKT-3 Bioxcell BE0001-2 Store at 4°C. Used for T cell depletion in primary AML samples. 
Cytokines (IL3, G-CSF, and TPO) PeproTech 200-03, 300-23 and 300-18 For doing the stock: Dilute each one of the cytokines in 100μL of water and mix them. Add 200μL, do alicuots of 45μL and Store at -20°C.
DMSO Sigma D4540
FBS Life technologies 10270106 Heat-inactivate at 56°C during 30 minutes, do aliquots and freeze down. Warm in 37°C water bath before use.
MEM-α Invitrogen 32571-028 Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use.
Myelocult H5100 corning 5100 Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use.
199 Gibco 41150-020 Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use.
hMSC-FBS, Heat-inactivated Gibco 12662-029 Store at -20°C. Warm in 37°C water bath before use.
P/S Sigma-Aldrich P0781 Store at -20°C. Warm in 37°C water bath before use.
ECGS Millipore 02-102 Dilute in culture media and use 0.22 mm filter.
HEPES Sigma-Aldrich S1558-50ML Store at 4°C.
Heparin Sigma-Aldrich H3149 Store at 4°C.
Glutamine Gibco 25030 Store at -20°C.
Collagen 1 coated cell culture plate corning 354505
Trypsin-EDTA solution Thermo-Fisher 25200056 Store at -20°C. Warm in 37°C water bath before use.
hMSC Lonza PT-2501 Alternatively, hMSCs we also kindly provided by Dr. Dosquet (University Paris Diderot, Paris) from human bone marrow obtained during orthopaedic surgery under ethical approval 10-038 from IRB00006477. 
VeraVec HUVEC endothelial cells Angiocrine bioscience hVera101
Human hematopoietic cells Umbilical Cord blood or primary Acute Myeloid Leukemia (AML) samples were obtained from the Royal London Hospital (London, UK) after informed consent and protocol of use was approved by the East London Ethical Committee and carried out in accordance with the Declaration of Helsinki. 
Gelfoam, Size 12-7mm Pfizer 00009-0315-08
PBS Thermo-Fisher 10010023
Surgical material Multiple Sterile forceps, tweezers and sharp scissors.
Sterile tissues Heat-sterilize paper tissues.
1 ml Syringe with needle of 25G Terumo SS+01H25161
Ultra Low Attachment Multiple Well Plates Corning 3473 or 3471
BMP2 Noricum rhBMP-2 Dilute at 5 mg/ml in acetic acid 50 mM and store at 4 °C.
Thrombin Sigma T9010 Dilute in CaCl2 2%, 500 mL per vial, and store at 4 °C.
Fibrinogen Sigma F3879 Dilute at 4 mg/100 mL in PBS. Store at -20C. Warm before use.
Tissue-culture dishes 35 mm x 10 mm Falcon 353001
U-Botton 96 well plate Falcon 353077
NSG mice The Jackson Laboratory 5557 NSG mice were a kind gift from Dr Leonard Shultz (The Jackson Laboratory).
Chlorhexidine G9 Dilute 1:10 before use
Carprofen Pfizer Rimadyl 5 mg/g of mouse
Buprenorphine Alstoe Vetergesic 0.1 mg/g of mouse body weight
Isoflurane Abbott B506 Induction of anaesthesia 2%, maintenance 1%
Trimmer Wella Contura HS61
Surgical glue 3M Vetbond
carbomer (polyacrylic acid)  as Ophthalmic gel Novartis Viscotears Liquid Gel
Human Normal Immunoglobulin Gammaplex 10g vial 100 ml/mouse intravenously, 30 min before infusion of specific antibody.
NT-QTracker Invitrogen Q21021MP Vessel-pooling agent. Administrate 15 ml/mouse intravenously 5 min before imaging.
AF488-hCD45 Biolegend 304017 100 ml/mouse intravenously, 30 min before imaging.
FITC-hCD31 BD Pharmigen 555445 100 ml/mouse intravenously, 30 min before imaging.
Super glue Loctite  Super Glue
Micro-Drill Kit IDEAL – Fisher Scientific NC9010016
Microsurgical microscope No specific brand/company is adviced.
LSM 710 NLO Zeiss Upright confocal microscope with motorized stage, two-photon laser and 20x 1.0 NA water immersion lens. Alternatively, a microscope with similar specifications could be used.
MaiTai “High Performance” fully automated 1-box 517 mode-locked Ti:Sapphire laser with DeepSee dispersion compensation  Spectra-Physics
Formalin solution, neutral buffered, 10%  Sigma-Aldrich HT501128
Ethanol Sigma-Aldrich 32294
Osteosoft Millipore 1.01728.1000
Polysine slices Thermo scientific J2800AMNZ
Antigen unmasking solution Vector H-3300 Store at 4 °C. Dilute 1:100 in H2O for working solution.
Triton 100x Sigma-Aldrich T9284
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A96470 Store at 4 °C.
Normal Goat serum (NGS) Sigma-Aldrich G9023 Store at 4 °C.
Endomucin Antibody Santa Cruz sc-65495 Store at 4 °C.
hVimentin antibody Santa Cruz sc-6260 Store at 4 °C.
hCD31 antibody DAKO M0823 Store at 4 °C.
hCD45 antibody DAKO M0701 Store at 4 °C.
ADRP (Perilipin2) antibodies-online ABIN283918 Store at 4 °C.
Goat anti mouse secondary antibodies Invitrogen A11029 or A11005 Store at 4 °C.
Goat anti Rabbit secondary antibodies Invitrogen A11037 or A11008 Store at 4 °C.
Goat anti Rat secondary antibodies Invitrogen A11007 or A21247 Store at 4 °C.
Sudan Black Sigma S2380 Prepare a stock of 1% sudan black in ethanol 70%. Store at RT. Prepare working solution of 0.1% sudan black in ethanol 70% and filter using filter-paper before use.
DAPI Sigma D8417 Prepare stock in H20 at 100 mg/mg. Store at 4 °C.
Fluorescent mounting media Dako S3023 Add DAPI before use (1:400 from DAPI stock).
Cover glass VWR 631-0147
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Passaro, D., Abarrategi, A., Foster, K., Ariza-McNaughton, L., Bonnet, D. Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging. J. Vis. Exp. (126), e55914, doi:10.3791/55914 (2017).
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