Анализ специфичности гистонового антитела с пептидными микрочипами

Геномная ДНК изящно упакована внутри ядра эукариотической клетки с белками гистонов с образованием хроматина. Повторяющейся субъединицей хроматина является нуклеосома, которая состоит из 147 пар оснований ДНК, обернутых вокруг октамерного ядра гистоновых белков – H2A, H2B, H3 и H4 ¹ . Хроматин широко организован в свободно упакованный эухроматин и плотно упакованные домены гетерохроматинов. Степень уплотнения хроматина регулирует степень, в которой белковые механизмы могут получить доступ к основной ДНК для осуществления фундаментальных процессов, связанных с ДНК, таких как репликация, транскрипция и восстановление.

Ключевыми регуляторами доступности генома в контексте хроматина являются ПТМ на неструктурированных хвостовых и основных доменах белков гистонов ^{2 , 3} . Гистоновые ПТМ функционируют напрямую, влияя на структуру хроматина ⁴ и косвенно проникаяH – набор белков-считывателей и связанных с ними макромолекулярных комплексов, которые имеют ремоделирование, ферментативную и лессификацию хроматина. ⁵ . Исследования функции гистонового ПТМ в течение последних двух десятилетий в подавляющем большинстве предполагают, что эти знаки играют ключевую роль в регулировании судьбы клеток, развития организма и инициирования / прогрессирования заболевания. Питаемые достижения в области масс – спектрометрия на основе протеомики технологии, более 20 уникальных гистоны PTMs на более чем 80 различных остатках гистонов были обнаружены ^6. Примечательно, что эти модификации часто встречаются в комбинациях и согласуются с гипотезой «гистонового кода», многочисленные исследования показывают, что белки-считыватели нацелены на дискретные области хроматина посредством распознавания специфических комбинаций гистоновых ПТМ ^{7 , 8 , 9} . Ключевой задачей продвижения вперед будет назначение функций grКоторый содержит список гистоновых ПТМ и определяет, как конкретные комбинации гистоновых ПТМ организуют динамические функции, связанные с хроматином.

Антитела – это линчпиновые реагенты для обнаружения гистоновых ПТМ. Таким образом, более 1000 гистоновых ПТМ-специфических антител были коммерчески разработаны для использования в исследованиях биохимии хроматина. С быстрым развитием высокопроизводительной технологии секвенирования ДНК эти реагенты широко используются отдельными исследователями и крупномасштабными инициативами «дорожной карты» эпигеномики ( например , ENCODE и BLUEPRINT) в ChIP-seq (иммунопреципитация хроматина в сочетании с последовательностью следующего поколения ) Для создания пространственных карт с высоким разрешением распределения генома гистонов в геноме ^{10 , 11} . Однако недавние исследования показали, что специфичность антител к гистону ПТМ может быть очень переменной и что эти реагенты проявляют Приемлемые свойства, такие как распознавание нецелевого эпитопа, сильное положительное и отрицательное влияние со стороны соседних ПТМ и трудности, определяющие порядок модификации на определенном остатке ( например , моно-, ди- или триметиллизине) ^{12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18} . Поэтому для точной интерпретации данных, полученных с помощью этих ценных реагентов, необходим строгий контроль качества реагентов антител, специфичных к гистону ПТМ.

Технология Microarray позволяет одновременный опрос тысяч макромолекулярных взаимодействий в высокопроизводительном, воспроизводимом и миниатюрном формате. По этой причине были созданы различные платформы для микрочипов для анализа белковой ДНК ^{19 ,}«> 20, белок-белок ²¹ и белок-пептидные взаимодействия ^22. Действительно, гистоновые пептидные микрочипы появились как информационная платформа для исследования биохимических свойств хроматина, позволяющая высокопрофильное профилирование писателей, ластиков и считывателей гистоновых ПТМ ^{15 , 23 , 24} , а также для анализа специфичности антител к гистону ^{17 , 25.} Вне их применения в исследованиях хроматина и эпигенетики гистоновые пептидные массивы имеют потенциальную полезность в качестве диагностического / прогностического теста для системной красной волчанки и других аутоиммунных заболеваний, Хроматиновые аутоантитела генерируются ^{26 , 27} .

Здесь мы описываем интегрированный конвейер, который мы разработали для проектирования, изготовления иДля получения микротипов гистоновых пептидов для получения профилей специфичности для антител, которые распознают гистоны и их ПТМ. Конвейер облегчается благодаря недавно разработанному ArrayNinja, интерактивному программному приложению с открытым исходным кодом, которое объединяет стадии проектирования и анализа экспериментов с микрочипами ²⁸ . ArrayNinja работает лучше всего в Google Chrome. Вкратце, роботизированный контактный микрочиповый принтер используется для осаждения библиотеки биотин-конъюгированных гистоновых пептидов в определенных положениях на стеклянных микроскопах, покрытых стрептавидином. Затем массивы можно использовать в конкурентном и параллельном анализе для опроса антитело-эпитопных взаимодействий ( рис. 1 ). Библиотека пептидов состоит из сотен уникальных синтетических пептидов, содержащих PTM (ацетилирование лизина, метилирование лизина / аргинина и фосфорилирование серина / треонина) и в соответствующих комбинациях, в основном полученных из наборов данных протеомики. Методы синтеза и валидации пептидов Подробно описаны в других разделах ²³ . Данные, полученные в ходе наших текущих скрининговых исследований скрининга антител к гистону, использующих эту платформу массивов, архивируются на общедоступном веб-ресурсе, базе данных специфичности антител Histone (www.histoneantibodies.com). Примечательно, что гистоновые пептидные микрочипы, изготовленные с вариациями этого протокола, также широко использовались для характеристики активности досок ^{8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37} гистоновых ПТМ-считывателей для профилирования гистона Запись PTT и ластик ²⁴ .

/files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg "/>
Рисунок 1: Мультяшное изображение пошаговой процедуры скрининга антител на микрочипе гистонового пептида. Биотинилированные гистоновые пептиды, содержащие определенные посттрансляционные модификации (красные и синие круги), совместно печатаются с биотин-флуоресцеином на стекле, покрытом стрептавидином. Положительные взаимодействия визуализируются как красная флуоресценция. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.