ניתוח של היסטון נוגדנים היסטון עם Microprays פפטיד
Summary
כתב היד מתאר שיטות להחלת הטכנולוגיה microarray פפטיד פרופיל פרופיליות של נוגדנים כי לזהות היסטונים ושינויים שלאחר translational שלהם.
Abstract
לאחר שינויים טרנסלציוניים (PTM) על חלבונים היסטון נחקרים באופן נרחב עבור תפקידים שלהם ויסות מבנה הכרומטין ביטוי גנים. ייצור המוני והפצה של נוגדנים ספציפיים PTMs היסטון יש להקל מאוד מחקר על סימנים אלה. כמו נוגדנים PTM היסטון הם ריאגנטים מפתח עבור יישומים ביוכימיה רבים הכרומטין, ניתוח קפדני של נוגדנים הספציפיות נחוץ לפרש נתונים מדויק והמשך ההתקדמות בתחום. פרוטוקול זה מתאר צינור משולב עבור ייצור, ייצור ושימוש של microprays פפטיד עבור אפיון הספציפיות של נוגדנים היסטון. עיצוב וניתוח היבטים של הליך זה הם הקלו על ידי ArrayNinja, קוד פתוח וחבילת תוכנה אינטראקטיבית פיתחנו לאחרונה כדי לייעל את ההתאמה האישית של פורמטים להדפיס microarray. צינור זה שימש למסך מספר רב של antibodie PTM זמין מסחרית בשימוש נרחבS, ונתונים שנוצרו בניסויים אלה זמינים באופן חופשי דרך האינטרנט והרחבת ההיסטון נוגדנים היסטון מסד נתונים. מעבר היסטונים, המתודולוגיה הכללית המתוארת כאן ניתן ליישם באופן רחב לניתוח של נוגדנים ספציפיים PTM.
Introduction
הדנ"א הגנומי הוא ארוז באלגנטיות בתוך גרעין התא האוקריוטים עם חלבונים היסטון ליצירת הכרומטין. יחידת המשנה של הכרומטין היא הנוקלאוזום, המורכב מ -147 זוגות בסיס של דנ"א עטופים סביב ליבה אוקטמית של חלבונים היסטוניים – H2A, H2B, H3 ו- H4 1 . הכרומטין מאורגן באופן כללי לתוך euchromatin ארוז רופף ותחומים heterochromatin ארוז בחוזקה. מידת הדחיסה הכרומטין מסדירה את המידה שבה machineries חלבון יכול לגשת DNA הבסיסית לבצע תהליכים בסיסיים DNA תבניות כמו שכפול, שעתוק, ותיקון.
רגולטורים עיקריים של נגישות הגנום בהקשר של הכרומטין הם PTM על זנב בלתי מובנה ותחומי הליבה של חלבונים היסטון 2 , 3 . Histone PTMs לתפקד ישירות על ידי השפעה על המבנה של הכרומטין 4 בעקיפין througH גיוס של חלבונים הקורא מתחמי macromolecular הקשורים להם כירומטין שיפוץ, פעילויות אנזימטיות, פיגומים 5 . מחקרים של פונקציה PTM היסטון במהלך שני העשורים האחרונים להצביע על הסימנים האלה לשחק תפקידים מרכזיים בוויסות גורל התא, התפתחות אורגניזמים, ואת תחילת המחלה / התקדמות. מונעת על ידי ההתקדמות של הטכנולוגיה מבוסס proteomic מבוססי ספקטרומטריית מסה, יותר מ -20 PTMs היסטון ייחודי על יותר מ 80 שאריות היסטון שונים התגלו 6 . יש לציין כי שינויים אלה מתרחשים לעיתים קרובות בשילובים, ועולים בקנה אחד עם ההשערה "קוד היסטון", מחקרים רבים מציעים כי חלבונים הקורא ממוקדות אזורים נפרדים של הכרומטין באמצעות הכרה של שילובים ספציפיים של PTMs היסטון 7 , 8 , 9 . אתגר מפתח להתקדם יהיה להקצות פונקציות לגררשימה של htone PTMs ולקבוע כיצד שילובים ספציפיים של PTMs היסטון לתזמר את הפונקציות דינמי הקשורים הכרומטין.
נוגדנים הם ריאגנטים lynchpin עבור זיהוי של PTMs היסטון. ככזה, יותר מ -1,000 נוגדנים ספציפיים PTM ספציפי היסטון פותחו מסחרית לשימוש במחקר ביוכימיה הכרומטין. עם התפתחות מהירה של התפוקה גבוהה דנ"א טכנולוגיית רצף, ריאגנטים אלה נמצאים בשימוש נרחב על ידי חוקרים בודדים בקנה מידה גדול epigenomics "מפת הדרכים" יוזמות ( למשל , ENCODE ו BLUEPRINT) ב שבב- seq (כרום immunoprecipitation הכרומטין עם הדור הבא רצף ) צינורות ליצור ברזולוציה גבוהה מפות מרחביות של היסטון PTM היסטון גנום רחב 10 , 11 . עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי הספציפיות של נוגדנים PTM היסטון יכול להיות משתנה מאוד וכי ריאגנטים אלה התערוכה unf תכונות אבורייביות כגון הכרה ב- epitope מחוץ להשפעה, השפעה חיובית ושלילית חזקה על-ידי PTM שכנות וקושי בהבחנה של סדר השינוי על שאריות מסוימת ( לדוגמה , מונו-די- או טרי-מתילייזין) 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . לכן, בקרת איכות קפדנית של ריאגנטים נוגדנים ספציפיים היסטון PTM יש צורך לפרש במדויק נתונים שנוצרו עם אלה ריאגנטים יקר.
טכנולוגיית Microarray מאפשרת חקירה סימולטנית של אלפי אינטראקציות macromolecular בתפוקה גבוהה, לשחזור, ואת פורמט ממוזער. מסיבה זו, מגוון של פלטפורמות microarray נוצרו לנתח חלבון DNA 19 ,"20, חלבון 21 חלבון, אינטראקציות חלבונים פפטיד 22. אכן, microstrays פפטיד היסטון צמחו כפלטפורמה גילוי אינפורמטיבי עבור מחקר ביוכימיה הכרומטין, המאפשר פרופיל התפוקה גבוהה של סופרים, מחקים, ו הקוראים של PTMs היסטון 15 , 23 , 24 , וכן לניתוח של נוגדנים הנוגדן היסטון 17 , 25. מעבר ליישום שלהם במחקר הכרומטין ו epigenetics, מערכי פפטיד היסטון יש פוטנציאל השירות כמו אבחון / בדיקה פרוגנוסטית זאבת מערכתית אריתמטוס ומחלות אוטואימוניות אחרות שבו אנטי- נוגדנים עצמיים הכרומטין נוצרים 26 , 27 .
כאן, אנו מתארים צינור משולב שפיתחנו עבור עיצוב, בודה, queRyan histone microptrays פפטיד כדי ליצור פרופילים ספציפיות עבור נוגדנים לזהות histones ו PTM שלהם. צינור הוא הקל על ידי ArrayNinja, קוד פתוח, יישום תוכנה אינטראקטיבית כי פיתחנו לאחרונה, המשלבת את שלבי התכנון והניתוח של ניסויים microarray 28 . ArrayNinja עובד הכי טוב ב- Google Chrome. בקצרה, מדפסת microarray קשר רובוטית משמש להפקיד ספריה של פפטידים היסטון ביוטין מצומדות במיקומים מוגדרים על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית streptavidin מצופה. מערכים לאחר מכן ניתן להשתמש בפורמט assay תחרותי במקביל לחקור אינטראקציות נוגדן-epitope ( איור 1 ). הספריה פפטיד מורכב מאות פפטידים סינתטיים ייחודי מחסה PTMs (ליזין acetylation, ליזין / מתילציה ארגינין, ו serine / threonine זרחון) לבד בשילובים רלוונטיים נגזר בעיקר מן הנתונים datasets proteomics. שיטות סינתזה פפטיד ואימות מפורטים במקום אחר 23. נתונים שנוצרו על ידי המתמשך שלנו histone PTM נוגדנים בדיקות הסינון באמצעות פלטפורמת מערך זה מאוחסנים על משאב אינטרנט ציבורי, היסטון נוגדנים היסטון מסד נתונים (www.histoneantibodies.com). יש לציין, כי microarrays היסטון פפטיד מפוברק עם וריאציות של פרוטוקול זה שימשו גם בהרחבה כדי לאפיין את פעילותם של תחומים הקורא PTM היסטון 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 ולאחרונה פרופיל היסטון PTM סופר ומחק פעילויות 24 .
/files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg "/>
איור 1: תיאור קריקטורה של נוהל שלב של הקרנת נוגדנים על micropray פפטיד היסטון. פפטידים היסטון Biotinylated מחסה שינויים שלאחר טרנסלציה מוגדרים (עיגולים אדומים וכחולים) מודפסים בשיתוף עם biotin-fluorescein על זכוכית מצופה streptavidin. אינטראקציות חיוביות הם דמיינו כמו פלואורסצנטי אדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Protocol
Representative Results
Discussion
אמינות נוגדנים ביישומים רפואיים ביו-רפואיים היא בעלת חשיבות עליונה 46 , 47 . זה נכון במיוחד בביוכימיה הכרומטין בהתחשב בעמדה של נוגדנים כמו כלי מפתח עבור רוב הטכניקות שפותחו כדי לאפיין את שפע והפצה של PTMs היסטון. הפרוטוקול המוצג כאן פרטים ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מכון המחקר ואן אנדל ומענק מחקר של המכונים הלאומיים לבריאות (CA181343) כדי SBR
Materials
| Printing Buffer | ArrayIt | PPB | |
| BSA | Omnipure | 2390 | |
| Streptavidin-coated glass microscope slides | Greiner Bio-one | 439003-25 | |
| polypropylene 384 well plate | Greiner Bio-one | 784201 | |
| Biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | |
| contact microarray printer | Aushon | 2470 | Aushon 2470 Microarray Printer |
| contact microarray printer | Gene Machines | OmniGrid 100 | OmniGrid Microarray Printer |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Blocking Buffer | ArrayIt | SBB | |
| Hydrophobic wax pen | Vector Labs | H-4000 | ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen |
| Silicon Gasket | Grace Bio-labs | 622511 | |
| Hybridization Vessel | Thermo Scientific | 267061 | or similar vessel |
| Fluorescent-dye conjugated secondary antibody | Life Technologies | A-21244 | Alexa Fluor 647 (anti-rabbit) |
| Fluorescent-dye conjugated secondary antibody | Life Technologies | A-21235 | Alexa Fluor 647 (anti-mouse) |
| Wax Imprinter | ArrayIt | MSI48 | |
| Tween-20 | Omnipure | 9490 | |
| Microarray Scanner | Innopsys | InnoScan 1100AL | or equivalent microarray scanner |
| EipTitan Histone Peptide Microarray | Epicypher | 112001 | |
| AbSurance Pro Histone Peptide Microarray | Millipore | 16668 | |
| MODified Histone Peptide Array | Active Motif | 13001 | |
| Histone Code Peptide Microarrays | JPT | His_MA_01 | |
| Wax | Royal Oak | GulfWax | for wax imprinter |
| Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber | VWR | 97000-284 | |
| High throughput microscope slide washing chamber | ArrayIt | HTW | |
| Microscope slide centrifuge | VWR | 93000-204 | |
| Antibody 1 | Abcam | 8898 | |
| Antibody 2 | Millipore | 07-473 | |
| Biotinylated histone peptide | EpiCypher | 12-0001 | Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources. |
| ImageMagick | https://www.imagemagick.org/script/index.php | ||
| ArrayNinja | https://rothbartlab.vai.org/tools/ |
References
- van Steensel, B. Chromatin: constructing the big picture. EMBO J. 30 (10), 1885-1895 (2011).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Rothbart, S. B., Strahl, B. D. Interpreting the language of histone and DNA modifications. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 627-643 (2014).
- Shogren-Knaak, M., Ishii, H., Sun, J. -. M., Pazin, M. J., Davie, J. R., Peterson, C. L. Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions. Science. 311 (5762), 844-847 (2006).
- Musselman, C. A., Lalonde, M. -. E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Huang, H., Sabari, B. R., Garcia, B. A., Allis, C. D., Zhao, Y. SnapShot: Histone Modifications. Cell. 159 (2), 458 (2014).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Rothbart, S. B., Krajewski, K., et al. Association of UHRF1 with methylated H3K9 directs the maintenance of DNA methylation. Nat Struct Mol Biol. 19 (11), 1155-1160 (2012).
- Wang, Z., Zang, C., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nat Genet. 40 (7), 897-903 (2008).
- Stunnenberg, H. G., Hirst, M. The International Human Epigenome Consortium: A Blueprint for Scientific Collaboration and Discovery. Cell. 167 (5), 1145-1149 (2016).
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Egelhofer, T. A., Minoda, A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Bock, I., Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Brandt, O., Rathert, P., Jeltsch, A. Detailed specificity analysis of antibodies binding to modified histone tails with peptide arrays. Epigenetics. 6 (2), 256-263 (2011).
- Busby, M., Xue, C., et al. Systematic comparison of monoclonal versus polyclonal antibodies for mapping histone modifications by ChIP-seq. Epigenetics Chromatin. 9, 49 (2016).
- Fuchs, S. M., Krajewski, K., Baker, R. W., Miller, V. L., Strahl, B. D. Influence of combinatorial histone modifications on antibody and effector protein recognition. Curr Biol. 21 (1), 53-58 (2011).
- Kungulovski, G., Jeltsch, A. Quality of histone modification antibodies undermines chromatin biology research. F1000Research. 4, 1160 (2015).
- Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
- Rothbart, S. B., Lin, S., et al. Poly-acetylated chromatin signatures are preferred epitopes for site-specific histone H4 acetyl antibodies. Sci Rep. 2, 489 (2012).
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nat Protoc. 4 (3), 393-411 (2009).
- Hu, S., Wan, J., et al. DNA methylation presents distinct binding sites for human transcription factors. eLife. 2, e00726 (2013).
- Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Curr Opin Chem Biol. 30, 21-27 (2016).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289 (5485), 1760-1763 (2000).
- Rothbart, S. B., Krajewski, K., Strahl, B. D., Fuchs, S. M. Peptide microarrays to interrogate the “histone code” . Methods Enzymol. 512, 107-135 (2012).
- Cornett, E. M., Dickson, B. M., et al. Substrate Specificity Profiling of Histone-Modifying Enzymes by Peptide Microarray. Methods Enzymol. 574, 31-52 (2016).
- Nady, N., Min, J., Kareta, M. S., Chédin, F., Arrowsmith, C. H. A SPOT on the chromatin landscape? Histone peptide arrays as a tool for epigenetic research. Trends Biochem Sci. 33 (7), 305-313 (2008).
- Dieker, J., Berden, J. H., et al. Autoantibodies against Modified Histone Peptides in SLE Patients Are Associated with Disease Activity and Lupus Nephritis. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
- Price, J. V., Tangsombatvisit, S., et al. “On silico” peptide microarrays for high-resolution mapping of antibody epitopes and diverse protein-protein interactions. Nat Med. 18 (9), 1434-1440 (2012).
- Dickson, B. M., Cornett, E. M., Ramjan, Z., Rothbart, S. B. ArrayNinja: An Open Source Platform for Unified Planning and Analysis of Microarray Experiments. Methods Enzymol. 574, 53-77 (2016).
- Gatchalian, J., Fütterer, A., et al. Dido3 PHD modulates cell differentiation and division. Cell Rep. 4 (1), 148-158 (2013).
- Cai, L., Rothbart, S. B., et al. An H3K36 methylation-engaging Tudor motif of polycomb-like proteins mediates PRC2 complex targeting. Mol Cell. 49 (3), 571-582 (2013).
- Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. Multivalent histone engagement by the linked tandem Tudor and PHD domains of UHRF1 is required for the epigenetic inheritance of DNA methylation. Genes Dev. 27 (11), 1288-1298 (2013).
- Ali, M., Rincón-Arano, H., et al. Molecular basis for chromatin binding and regulation of MLL5. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (28), 11296-11301 (2013).
- Kinkelin, K., Wozniak, G. G., Rothbart, S. B., Lidschreiber, M., Strahl, B. D., Cramer, P. Structures of RNA polymerase II complexes with Bye1, a chromatin-binding PHF3/DIDO homologue. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (38), 15277-15282 (2013).
- Klein, B. J., Piao, L., et al. The histone-H3K4-specific demethylase KDM5B binds to its substrate and product through distinct PHD fingers. Cell Rep. 6 (2), 325-335 (2014).
- Kim, H. -. S., Mukhopadhyay, R., et al. Identification of a BET family bromodomain/casein kinase II/TAF-containing complex as a regulator of mitotic condensin function. Cell Rep. 6 (5), 892-905 (2014).
- Greer, E. L., Beese-Sims, S. E., et al. A histone methylation network regulates transgenerational epigenetic memory in C. elegans. Cell Rep. 7 (1), 113-126 (2014).
- Andrews, F. H., Tong, Q., et al. Multivalent Chromatin Engagement and Inter-domain Crosstalk Regulate MORC3 ATPase. Cell Rep. 16 (12), 3195-3207 (2016).
- Sidoli, S., Lin, S., Karch, K. R., Garcia, B. A. Bottom-Up and Middle-Down Proteomics Have Comparable Accuracies in Defining Histone Post-Translational Modification Relative Abundance and Stoichiometry. Anal Chem. 87 (6), 3129-3133 (2015).
- Tsukada, Y., Ishitani, T., Nakayama, K. I. KDM7 is a dual demethylase for histone H3 Lys 9 and Lys 27 and functions in brain development. Genes Dev. 24 (5), 432-437 (2010).
- Tachibana, M., Sugimoto, K., Fukushima, T., Shinkai, Y. Set domain-containing protein, G9a, is a novel lysine-preferring mammalian histone methyltransferase with hyperactivity and specific selectivity to lysines 9 and 27 of histone H3. J Biol Chem. 276 (27), 25309-25317 (2001).
- Wu, H., Chen, X., et al. Histone methyltransferase G9a contributes to H3K27 methylation in vivo. Cell Res. 21 (2), 365-367 (2011).
- Koch, C. M., Andrews, R. M., et al. The landscape of histone modifications across 1% of the human genome in five human cell lines. Genome Res. 17 (6), 691-707 (2007).
- Okitsu, C. Y., Hsieh, J. C. F., Hsieh, C. -. L. Transcriptional Activity Affects the H3K4me3 Level and Distribution in the Coding Region. Mol Cell Biol. 30 (12), 2933-2946 (2010).
- Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Res. 21 (8), 1273-1283 (2011).
- Garske, A. L., Oliver, S. S., et al. Combinatorial profiling of chromatin binding modules reveals multisite discrimination. Nat Chem Biol. 6 (4), 283-290 (2010).
- Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
- Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 518 (7537), 27-29 (2015).
- Nguyen, U. T. T., Bittova, L., et al. Accelerated chromatin biochemistry using DNA-barcoded nucleosome libraries. Nat Methods. 11 (8), 834-840 (2014).
- Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).
- Hilpert, K., Winkler, D. F. H., Hancock, R. E. W. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
- Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203 (2014).
