تحليل هيستون الأجسام المضادة خصوصية مع ميكروأرس الببتيد
Summary
تصف هذه المخطوطة طرق لتطبيق تقنية ميكروأري الببتيد على التنميط خصوصية الأجسام المضادة التي تعترف هيستونيس والتعديلات بعد متعدية لها.
Abstract
يتم دراسة التعديلات بعد متعدية (بتمس) على البروتينات هيستون على نطاق واسع لدورها في تنظيم هيكل الكروماتين والتعبير الجيني. وقد سهل الإنتاج الضخم وتوزيع الأجسام المضادة المحددة ل هيستون بتمس إلى حد كبير البحث على هذه العلامات. كما هيستون الأجسام المضادة بتم هي الكواشف الرئيسية للعديد من الكروماتين تطبيقات الكيمياء الحيوية، تحليل دقيق للخصوصية الأجسام المضادة ضروري لتفسير البيانات دقيقة والتقدم المستمر في هذا المجال. يصف هذا البروتوكول خط أنابيب متكامل لتصميم وتصنيع واستخدام ميكروأرس الببتيد لتنميط خصوصية الأجسام المضادة هيستون. يتم تسهيل جوانب التصميم والتحليل من هذا الإجراء من قبل أرينينيا، مفتوحة المصدر وتفاعلية حزمة البرامج التي قمنا بتطويرها مؤخرا لتبسيط تخصيص صيغ الطباعة ميكروأري. وقد استخدمت هذه الأنابيب لفحص عدد كبير من المتاحة تجاريا وتستخدم على نطاق واسع هيستون بتم أنتيبوديs، والبيانات التي تم إنشاؤها من هذه التجارب متاحة بحرية من خلال قاعدة بيانات خصوصية هيستون الأجسام المضادة على الانترنت وتوسيعها. ما وراء الهستونات، المنهجية العامة الموصوفة هنا يمكن تطبيقها على نطاق واسع لتحليل الأجسام المضادة بتم محددة.
Introduction
يتم تعبئة الحمض النووي الجيني بشكل أنيق داخل النواة النواة النواة النواة مع بروتينات هيستون لتكوين الكروماتين. وحدة فرعية من الكروماتين تكرار هو نوكليوسوم، والذي يتكون من 147 زوجا قاعدة من الحمض النووي ملفوفة حول جوهر أوكتامريك من البروتينات هيستون – H2A، H2B، H3، و H4 1 . وينظم الكروماتين على نطاق واسع في يوكروماتين معبأة فضفاضة ومجالات هيتيروكروماتين معبأة بإحكام. درجة ضغط الكروماتين ينظم المدى الذي يمكن للأجهزة البروتين الوصول إلى الحمض النووي الأساسي لتنفيذ العمليات الأساسية الحمض النووي مثل النسخ المتماثل، والنسخ، وإصلاح.
المنظمين الرئيسيين للوصول الجينوم في سياق لونين هي بتمس على الذيل غير المهيكلة والنطاقات الأساسية للبروتينات هيستون 2 ، 3 . هيستون بتمس وظيفة مباشرة من خلال التأثير على بنية لونين 4 وغير مباشر ثروغح تجنيد بروتينات القارئ والمجمعات الجزيئات المرتبطة بها التي لديها إعادة عرض لونين، الأنزيمية، والأنشطة السقالات 5 . دراسات على وظيفة هيستون بتم على مدى العقدين الماضيين تقترح بأغلبية ساحقة هذه العلامات تلعب الأدوار الرئيسية في تنظيم مصير الخلية، والتنمية الكائن الحي، ومرض بدء / التقدم. مدعوم من التقدم في تكنولوجيا الطيف الكتلي المستندة إلى البروتين، تم اكتشاف أكثر من 20 بتمس هيستون فريدة من نوعها على أكثر من 80 مخلفات هيستون متميزة 6 . ومن الجدير بالذكر أن هذه التعديلات غالبا ما تحدث في توليفات، وتمشيا مع فرضية "هيستون كود"، العديد من الدراسات تشير إلى أن البروتينات القارئ تستهدف مناطق منفصلة من الكروماتين من خلال الاعتراف مجموعات محددة من هيستون بتمس 7 ، 8 ، 9 . والتحدي الرئيسي الذي سيتحرك إلى الأمام هو تعيين وظائف إلى غربسبب قائمة هيتمون بتمس وتحديد كيفية تركيبات محددة من هيستون بتمس أوركسترات وظائف ديناميكية المرتبطة بالكروماتين.
الأجسام المضادة هي الكواشف لينكبين للكشف عن هيستون بتمس. وعلى هذا النحو، فقد تم تطوير أكثر من 1000 هيستون من الأجسام المضادة المتمثلة في هيتمون تجاريا لاستخدامها في أبحاث الكيمياء الحيوية للكروماتين. مع التطور السريع لتكنولوجيا تسلسل الحمض النووي عالية الإنتاجية، وتستخدم هذه الكواشف على نطاق واسع من قبل المحققين الفردية وعلى نطاق واسع إبيجنوميكس "خارطة الطريق" المبادرات (على سبيل المثال ، إنكود و بوبرينت) في تشيب-سيق (الكروماتين مناعي إلى جانب الجيل القادم التسلسل ) لتوليد خرائط المكانية عالية الدقة لتوزيع هيستون بتم على نطاق الجينوم 10 ، 11 . ومع ذلك، أظهرت الدراسات الحديثة أن خصوصية الأجسام المضادة هيستون بتم يمكن أن تكون متغيرة للغاية، وأن هذه الكواشف تظهر غير صالحة ( مثل ، أحادي أو ثنائي أو ثلاثي ميليليسين) 12 و 13 و 14 و 15 ، 16 ، 17 ، 18 . لذلك، مراقبة الجودة الصارمة من هيستون بتم-الكواشف الأجسام المضادة محددة ضروري لتفسير البيانات التي تم إنشاؤها بدقة مع هذه الكواشف القيمة.
تكنولوجيا ميكروأري تمكن الاستجواب في وقت واحد من الآلاف من التفاعلات الجزيئية في إنتاجية عالية، استنساخه، وتصغيرها الشكل. لهذا السبب، تم إنشاء مجموعة متنوعة من منصات ميكروأري لتحليل البروتين الحمض النووي 19 ،"> 20 والبروتينات البروتين 21 ، والتفاعلات الببتيد البروتين 22. في الواقع، وقد ظهرت ميكروأرس الببتيد هيستون كمنصة اكتشاف بالمعلومات للبحوث الكيمياء الحيوية لونين، مما يتيح التنميط الإنتاجية العالية للكتاب، محايات، وقراء هيستون بتمس 15 ، 23 ، 24 ، وأيضا لتحليل هيستون خصوصية الأجسام المضادة 17 ، 25. أبعد من تطبيقها في الكروماتين والبحوث علم الوراثة، صفائف الببتيد هيستون لها فائدة محتملة كاختبار التشخيص / النذير لذئبة الحمامية الجهازية وأمراض المناعة الذاتية الأخرى حيث المضادة للالتهابات، يتم إنشاء الأجسام المضادة لونين 26 ، 27 .
هنا، نحن تصف خط أنابيب المتكاملة التي وضعناها لتصميم، تلفيق، و كيوريجين هيبتون ميكروأرس هيستون لتوليد ملامح خصوصية للأجسام المضادة التي تعترف هيستونيس و بتمس بهم. ويسهل خط الأنابيب من قبل أرينينيا، مفتوح المصدر، وتطبيق البرمجيات التفاعلية التي قمنا بتطويرها مؤخرا، والذي يدمج مراحل التصميم والتحليل من التجارب ميكروأري 28 . تعمل أرينينيا بشكل أفضل في غوغل كروم. باختصار، يتم استخدام طابعة ميكروأري الاتصال الروبوتية لإيداع مكتبة من البيوتين هيتون الببتيدات مترافق البيوتين في مواقف محددة على شرائح المجهر الزجاج ستريبتافيدين المغلفة. صفائف يمكن بعد ذلك أن تستخدم في شكل مقايسة تنافسية ومتوازية لاستجواب التفاعلات الأجسام المضادة-حاتمة ( الشكل 1 ). تتكون مكتبة الببتيد من مئات من الببتيدات الاصطناعية الفريدة التي تؤوي بتمس (ليسين أسيتيلاتيون، ليسين / أرجينين مثيلة، و سيرين / ثريونين فسفوريلاتيون) وحدها وفي توليفات ذات صلة مستمدة إلى حد كبير من مجموعات بروتيوميكس. طرق لتوليف الببتيد والتحقق من صحة مفصلة في مكان آخر 23 . يتم تخزين البيانات التي تم إنشاؤها من جهودنا الحالية هيستون بتم الكشف عن الأجسام المضادة باستخدام هذه المنصة مجموعة على الموارد على شبكة الإنترنت العامة، وهيستون هيتيون الأجسام المضادة قاعدة بيانات (www.histoneantibodies.com). ومن الجدير بالذكر أن هيستون الببتيد ميكروأرس ملفقة مع الاختلافات من هذا البروتوكول كما استخدمت على نطاق واسع لتوصيف نشاط هيستون بتم القارئ المجالات 8 و 29 و 30 و 31 و 32 و 33 و 34 و 35 و 36 و 37 ومؤخرا إلى ملف هيستون بتم الكاتب و الممحاة الأنشطة 24 .
/files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg "/>
الشكل 1: رسم كاريكاتوري من الإجراء تدريجي لفحص الأجسام المضادة على هيستون الببتيد ميكروأري. الببتيدات هيستون البيروكسيديز الإيواء تعريف التعديلات بعد متعدية (الدوائر الحمراء والزرقاء) هي شارك في طباعة مع البيوتين فلوريسئين على الزجاج المغلفة ستريبتافيدين. يتم تصور التفاعلات الإيجابية كما مضان أحمر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
موثوقية الأجسام المضادة في تطبيقات البحوث الطبية الحيوية أمر بالغ الأهمية 46 ، 47 . هذا صحيح بشكل خاص في الكيمياء الحيوية لونين نظرا لموقف الأجسام المضادة كأدوات رئيسية لغالبية التقنيات المتقدمة لتوصيف وفرة وتوزيع هيتمون بتمس. بروتوكو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل في جزء من معهد بحوث فان أندل ومنحة بحثية من المعاهد الوطنية للصحة (CA181343) ل سبر
Materials
| Printing Buffer | ArrayIt | PPB | |
| BSA | Omnipure | 2390 | |
| Streptavidin-coated glass microscope slides | Greiner Bio-one | 439003-25 | |
| polypropylene 384 well plate | Greiner Bio-one | 784201 | |
| Biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | |
| contact microarray printer | Aushon | 2470 | Aushon 2470 Microarray Printer |
| contact microarray printer | Gene Machines | OmniGrid 100 | OmniGrid Microarray Printer |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Blocking Buffer | ArrayIt | SBB | |
| Hydrophobic wax pen | Vector Labs | H-4000 | ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen |
| Silicon Gasket | Grace Bio-labs | 622511 | |
| Hybridization Vessel | Thermo Scientific | 267061 | or similar vessel |
| Fluorescent-dye conjugated secondary antibody | Life Technologies | A-21244 | Alexa Fluor 647 (anti-rabbit) |
| Fluorescent-dye conjugated secondary antibody | Life Technologies | A-21235 | Alexa Fluor 647 (anti-mouse) |
| Wax Imprinter | ArrayIt | MSI48 | |
| Tween-20 | Omnipure | 9490 | |
| Microarray Scanner | Innopsys | InnoScan 1100AL | or equivalent microarray scanner |
| EipTitan Histone Peptide Microarray | Epicypher | 112001 | |
| AbSurance Pro Histone Peptide Microarray | Millipore | 16668 | |
| MODified Histone Peptide Array | Active Motif | 13001 | |
| Histone Code Peptide Microarrays | JPT | His_MA_01 | |
| Wax | Royal Oak | GulfWax | for wax imprinter |
| Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber | VWR | 97000-284 | |
| High throughput microscope slide washing chamber | ArrayIt | HTW | |
| Microscope slide centrifuge | VWR | 93000-204 | |
| Antibody 1 | Abcam | 8898 | |
| Antibody 2 | Millipore | 07-473 | |
| Biotinylated histone peptide | EpiCypher | 12-0001 | Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources. |
| ImageMagick | https://www.imagemagick.org/script/index.php | ||
| ArrayNinja | https://rothbartlab.vai.org/tools/ |
References
- van Steensel, B. Chromatin: constructing the big picture. EMBO J. 30 (10), 1885-1895 (2011).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Rothbart, S. B., Strahl, B. D. Interpreting the language of histone and DNA modifications. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 627-643 (2014).
- Shogren-Knaak, M., Ishii, H., Sun, J. -. M., Pazin, M. J., Davie, J. R., Peterson, C. L. Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions. Science. 311 (5762), 844-847 (2006).
- Musselman, C. A., Lalonde, M. -. E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Huang, H., Sabari, B. R., Garcia, B. A., Allis, C. D., Zhao, Y. SnapShot: Histone Modifications. Cell. 159 (2), 458 (2014).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Rothbart, S. B., Krajewski, K., et al. Association of UHRF1 with methylated H3K9 directs the maintenance of DNA methylation. Nat Struct Mol Biol. 19 (11), 1155-1160 (2012).
- Wang, Z., Zang, C., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nat Genet. 40 (7), 897-903 (2008).
- Stunnenberg, H. G., Hirst, M. The International Human Epigenome Consortium: A Blueprint for Scientific Collaboration and Discovery. Cell. 167 (5), 1145-1149 (2016).
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Egelhofer, T. A., Minoda, A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Bock, I., Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Brandt, O., Rathert, P., Jeltsch, A. Detailed specificity analysis of antibodies binding to modified histone tails with peptide arrays. Epigenetics. 6 (2), 256-263 (2011).
- Busby, M., Xue, C., et al. Systematic comparison of monoclonal versus polyclonal antibodies for mapping histone modifications by ChIP-seq. Epigenetics Chromatin. 9, 49 (2016).
- Fuchs, S. M., Krajewski, K., Baker, R. W., Miller, V. L., Strahl, B. D. Influence of combinatorial histone modifications on antibody and effector protein recognition. Curr Biol. 21 (1), 53-58 (2011).
- Kungulovski, G., Jeltsch, A. Quality of histone modification antibodies undermines chromatin biology research. F1000Research. 4, 1160 (2015).
- Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
- Rothbart, S. B., Lin, S., et al. Poly-acetylated chromatin signatures are preferred epitopes for site-specific histone H4 acetyl antibodies. Sci Rep. 2, 489 (2012).
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nat Protoc. 4 (3), 393-411 (2009).
- Hu, S., Wan, J., et al. DNA methylation presents distinct binding sites for human transcription factors. eLife. 2, e00726 (2013).
- Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Curr Opin Chem Biol. 30, 21-27 (2016).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289 (5485), 1760-1763 (2000).
- Rothbart, S. B., Krajewski, K., Strahl, B. D., Fuchs, S. M. Peptide microarrays to interrogate the “histone code” . Methods Enzymol. 512, 107-135 (2012).
- Cornett, E. M., Dickson, B. M., et al. Substrate Specificity Profiling of Histone-Modifying Enzymes by Peptide Microarray. Methods Enzymol. 574, 31-52 (2016).
- Nady, N., Min, J., Kareta, M. S., Chédin, F., Arrowsmith, C. H. A SPOT on the chromatin landscape? Histone peptide arrays as a tool for epigenetic research. Trends Biochem Sci. 33 (7), 305-313 (2008).
- Dieker, J., Berden, J. H., et al. Autoantibodies against Modified Histone Peptides in SLE Patients Are Associated with Disease Activity and Lupus Nephritis. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
- Price, J. V., Tangsombatvisit, S., et al. “On silico” peptide microarrays for high-resolution mapping of antibody epitopes and diverse protein-protein interactions. Nat Med. 18 (9), 1434-1440 (2012).
- Dickson, B. M., Cornett, E. M., Ramjan, Z., Rothbart, S. B. ArrayNinja: An Open Source Platform for Unified Planning and Analysis of Microarray Experiments. Methods Enzymol. 574, 53-77 (2016).
- Gatchalian, J., Fütterer, A., et al. Dido3 PHD modulates cell differentiation and division. Cell Rep. 4 (1), 148-158 (2013).
- Cai, L., Rothbart, S. B., et al. An H3K36 methylation-engaging Tudor motif of polycomb-like proteins mediates PRC2 complex targeting. Mol Cell. 49 (3), 571-582 (2013).
- Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. Multivalent histone engagement by the linked tandem Tudor and PHD domains of UHRF1 is required for the epigenetic inheritance of DNA methylation. Genes Dev. 27 (11), 1288-1298 (2013).
- Ali, M., Rincón-Arano, H., et al. Molecular basis for chromatin binding and regulation of MLL5. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (28), 11296-11301 (2013).
- Kinkelin, K., Wozniak, G. G., Rothbart, S. B., Lidschreiber, M., Strahl, B. D., Cramer, P. Structures of RNA polymerase II complexes with Bye1, a chromatin-binding PHF3/DIDO homologue. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (38), 15277-15282 (2013).
- Klein, B. J., Piao, L., et al. The histone-H3K4-specific demethylase KDM5B binds to its substrate and product through distinct PHD fingers. Cell Rep. 6 (2), 325-335 (2014).
- Kim, H. -. S., Mukhopadhyay, R., et al. Identification of a BET family bromodomain/casein kinase II/TAF-containing complex as a regulator of mitotic condensin function. Cell Rep. 6 (5), 892-905 (2014).
- Greer, E. L., Beese-Sims, S. E., et al. A histone methylation network regulates transgenerational epigenetic memory in C. elegans. Cell Rep. 7 (1), 113-126 (2014).
- Andrews, F. H., Tong, Q., et al. Multivalent Chromatin Engagement and Inter-domain Crosstalk Regulate MORC3 ATPase. Cell Rep. 16 (12), 3195-3207 (2016).
- Sidoli, S., Lin, S., Karch, K. R., Garcia, B. A. Bottom-Up and Middle-Down Proteomics Have Comparable Accuracies in Defining Histone Post-Translational Modification Relative Abundance and Stoichiometry. Anal Chem. 87 (6), 3129-3133 (2015).
- Tsukada, Y., Ishitani, T., Nakayama, K. I. KDM7 is a dual demethylase for histone H3 Lys 9 and Lys 27 and functions in brain development. Genes Dev. 24 (5), 432-437 (2010).
- Tachibana, M., Sugimoto, K., Fukushima, T., Shinkai, Y. Set domain-containing protein, G9a, is a novel lysine-preferring mammalian histone methyltransferase with hyperactivity and specific selectivity to lysines 9 and 27 of histone H3. J Biol Chem. 276 (27), 25309-25317 (2001).
- Wu, H., Chen, X., et al. Histone methyltransferase G9a contributes to H3K27 methylation in vivo. Cell Res. 21 (2), 365-367 (2011).
- Koch, C. M., Andrews, R. M., et al. The landscape of histone modifications across 1% of the human genome in five human cell lines. Genome Res. 17 (6), 691-707 (2007).
- Okitsu, C. Y., Hsieh, J. C. F., Hsieh, C. -. L. Transcriptional Activity Affects the H3K4me3 Level and Distribution in the Coding Region. Mol Cell Biol. 30 (12), 2933-2946 (2010).
- Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Res. 21 (8), 1273-1283 (2011).
- Garske, A. L., Oliver, S. S., et al. Combinatorial profiling of chromatin binding modules reveals multisite discrimination. Nat Chem Biol. 6 (4), 283-290 (2010).
- Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
- Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 518 (7537), 27-29 (2015).
- Nguyen, U. T. T., Bittova, L., et al. Accelerated chromatin biochemistry using DNA-barcoded nucleosome libraries. Nat Methods. 11 (8), 834-840 (2014).
- Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).
- Hilpert, K., Winkler, D. F. H., Hancock, R. E. W. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
- Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203 (2014).
