Fare T-hücresi Hatlarında Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP)
Summary
Bu çalışma olgun bir fare T-hücresi hattı kullanarak kromatin immüno çökeltme (ChIP) için bir protokolü açıklamaktadır. Bu protokol, spesifik histon marklarının belirli promotör alanlarında veya genom çapında dağılımını araştırmak için uygundur.
Abstract
Sinyal yolakları, histon kuyruklarının post translasyonel modifikasyonları (PTM'ler), histon varyantları ile kanonik histonların değişimi ve nükleozom tahliye gibi farklı seviyelerde kromatin yapısının modülasyonu yoluyla gen ekspresyon programlarını düzenler. Bu düzenleme, arttırıcılar olarak tanımlanan düzenleyici elemanlarda kromatin değiştirici enzimleri işe yarayan sinyal duyarlı transkripsiyon faktörlerinin (TF'ler) bağlanmasını gerektirir. Sinyal olay kaskadlarının arttırıcı aktiviteyi nasıl düzenlediğini anlamak TF'lerin, kromatin değiştirici enzimlerin bağlanmasının ve spesifik histon işaretlerinin ve histon varyantlarının dolaşımının kapsamlı bir analizini gerektirir. Kromatin immüno-çökeltme (ChIP) tahlilleri, spesifik protein / DNA komplekslerini immüno-çökeltmek için yüksek spesifik antikorları kullanır. Saflaştırılmış DNA'nın sonraki analizi, antikor tarafından tanınan protein tarafından işgal edilen bölgenin tanımlanmasına izin verir. Bu çalışma verimli bir şekilde peOlgun fare T hücre dizisinde histon proteinlerinin ChIP'ini oluşturun. Sunulan protokol, ChIP tahlillerinin makul bir zaman aralığında ve yüksek tekrarlanabilirlik ile gerçekleştirilmesini sağlar.
Introduction
Gelişme, farklılaşma ve homeostaz, kromatin yapısını modüle eden ve bu nedenle belirli bir genin bir hücre ve zamana özgü biçimde aktive edilip engellenmediğini belirleyen olayları bildiren belirli gen ekspresyon programlarına bağlıdır. T-hücresi gelişimi sırasında, birkaç ara evreden 1 geçerek çift negatif (DN) ila tek pozitif (SP) haldeki T hücresi öncüllerinin olgunlaşmasını doğru bir şekilde belirlemek için spesifik gen ekspresyon programları oluşturulmalıdır. Gen ekspresyon programının T hücresi gelişimi sırasında dinamik olarak nasıl düzenlendiği, önceki laboratuvarlarda 2 , 3 , 4 , 5 , 6 numaralı laboratuvarlar tarafından geniş çapta araştırılmıştır.
Histonların post translasyonel modifikasyonları (PTM'ler) ile,Histon varyantlarına sahip kanonik histonlar, nükleozom tahliye ve DNA metilasyonu, genlerin ON / OFF anahtarını düzenler. Çeşitli gruplar, proksimal ve distal düzenleyici bölgelerde 7 , 8 , 9 , 10 farklı kromatin durumlarıyla ilişkili işaretleri belirlemek için PTM'lerin ve histon varyantlarının genom çapında dağılımını araştırdılar. Sinyalizasyon, spesifik arttırıcı elementlerde pozitif ve negatif kromatin değiştirici enzimlerin (ayrıca kromatin modifiye edici olarak da bilinir) değişimi yoluyla dinamik kromatin düzenlenişini düzenler. Bu kromatin değiştiriciler kromatin yapısını ve dolayısıyla transkripsiyonel çıktıyı örneğin dinamik histon metilasyonu ve asetilasyon ile düzenler. Notch sinyal yolunda 11 , 12 , 13 ,14.
Dinamik histon PTM'leri; Histon varyantları ile alışverişler; Ve histonların, transkripsiyon faktörlerinin ve kofaktörlerin dinamik dolaşımı, kromatin immüno-çökeltme (ChIP) tahlilleri ile araştırılabilir. Belirli DNA-protein komplekslerini saflaştırmak için oldukça spesifik antikorlar kullanılır ve saflaştırılmış DNA kantitatif PCR (qPCR) ile analiz edilir; Derin dizilim (ChIP-Seq); Veya günümüzde daha az sıklıkla, mikrodiziye hibridizasyon (ChIP-ChIP).
ChIP tahlilleri, bazen hücrelerin lizisi, kromatin kesilmesi ve / veya antikorların düşük özgüllüğü ile ilgili komplikasyonlar nedeniyle zorlayıcıdır. NEXSON 15'te olduğu gibi, protokolü geliştirmek için çeşitli stratejiler benimsenmiştir. Soğutma suyu banyosu sonikatörlerinin kullanılması, araştırılan protein üzerindeki epitoplara zarar verebilecek numune ısıtmasından kaçınır, ancak numunelerin kesilmesi için gereken enerji suya dağılır.Enerjinin dağılmasını önleyen odaklanmış ultrasonication cihazlarının geliştirilmesi ile bir başka gelişme yapılmıştır. Bu nedenle, odaklanmış ultrasonatör cihazları, hücre lizizinde ve kromatin makaslamada iyileştirme yapmaya, operatöre bağlı varyasyonları ortadan kaldırmaya ve tekrarlanabilirliği önemli ölçüde arttırmaya olanak tanır.
Bu çalışma , E2-10HA 16 , 17 olarak adlandırılan olgun bir fare T hücresi çizgisindeki histon proteinlerinin ChIP'ini etkili bir şekilde gerçekleştirmek için bir protokolü ( Şekil 1'deki şematik genel bilgi) açıklar. T-hücrelerinin çözülmesi genellikle zordur ve kromatinlerinin kesilmesi yetersizdir. Soğutma odaklı bir ultrasonatörü kullanan bu protokolde, hücre sayısı, liziz tamponu ve kesme ayarı E2-10HA fare T hücre dizisi için optimize edildi. Bu protokol, yüksek bir tekrarlanabilirlik ve makul bir zamanda ChIP gerçekleştirmesine olanak tanır. Aslında, requirKromatin kesmek ve makaslama kalitesini değerlendirmek için yaklaşık iki gün, immüno çökelmeyi gerçekleştirmek için üç gün, çapraz bağın tersini çevirin ve DNA'yı arındırın.
Protocol
Representative Results
Discussion
ChIP, proteinlerin veya bunların PTM'lerinin spesifik genomik bölgede zenginleşip zenginleşmediğini araştırmak için geçerli bir tekniktir. ChIP test sonuçları biyolojik veya teknik nedenlerden dolayı genellikle yorum yapmakla zorlanır. Biyolojik nedenler çok katlıdır ve proteinlerin DNA'ya zayıf veya dolaylı olarak bağlanmasını içerir. Sınırlı antikor özgüllüğü ve verimsiz hücre lizisi veya kromatin kesme gibi teknik sınırlamalar da vardır. Bir sorun giderme kılavuzu ( Çizelge 5 ), okuyucunun ChIP analizlerinde karşılaşılabilecek sorunları çözmesine yardımcı olabilir.
Soğutma odaklı bir ultrasonator cihazından yararlanan bu protokol, olgunlaşmış bir fare T hücre çizgisinin kromatinini verimli bir şekilde kesmesine izin verir. Protokolün asıl kritik basamağı, her zaman her hücre tipi için optimize edilmiş olması gereken kromatin kesilmesi ile temsil edilir. Hücrelerin sayısını ve sonikasyon çevrimlerinin sayısını değiştirmek önerilir. Ayrıca, o SDS liziz tamponu ile buz üzerinde hücrelerin lizizi sırasında oluşabilecek örneklerdeki SDS çökeltilerinin varlığı olumsuz etkilenir. Bu durumda, SDS çökeltilerinin varlığını azaltmak için numuneyi oda sıcaklığında birkaç dakika boyunca lüsizasyondan sonra inkübe etmek en iyisidir. 200 ile 500 bp arasında kesilmiş fragmanları elde etmek için protokolü optimize etmek ve immüno çökeltme işlemine başlamadan önce numunelerin kesilme kalitesini daima değerlendirmek önerilir. Ayrıca sabitleme zamanı, antikor ve / veya hücrelerin miktarı ve yıkama koşulları, her bir antikor için optimize edilmelidir.
Bir ChIP prosedürünü başarılı bir hale getirirken bir diğer kritik adım, antikorun seçilmesidir, çünkü düşük özgünlük antikorları immüno çökelmenin etkinliğini önemli ölçüde azaltır. Daha önce, piyasada bulunan çeşitli antikorların özgüllüğünün değerlendirilmesine izin verilen birleştirilmiş bir kalite testi prosedürü Ss = "xref"> 19. Tarama hattı, dot blot, Western blot ve ChIP'e dayanılarak ChIP 19 için uygun yüksek kaliteli reaktiflerin bir listesi sağladı. Daha yakın zamanlarda, ticari olarak temin edilebilen birkaç antikorun spesifitesi, antikor özgüllüğü üzerine bir veri tabanının oluşturulmasına izin veren, yüksek yoğunluklu histon peptid mikrodizi platformları kullanılarak değerlendirildi. Okuyucu ChIP deneyleri için kullanılabilecek en spesifik antikorları tanımlamak için bu yararlı aracı kullanabilir.
Bu protokol, birincil T hücreleri için test edilmemiştir ve bu durumda okuyucu, birincil T hücreleri 3 , 4 ve 21 üzerinde ChIP'yi başarılı bir şekilde gerçekleştiren yayınlanmış protokollere başvurmalıdır. Özellikle, bu protokol bir fare endojen hücre hattının yanı sıra bir fare progenitör T-hücresi hattı üzerinde ChIP'i başarıyla yerine getirmek için kullanılmıştır.
Ove_content "> Histon işaretlerinin analizi için her immüno çökelme için 5 x 106 hücre kullanılmalıdır.Bu protokol TF'ler veya kofaktörler üzerinde ChIP gerçekleştirmek için bazı optimizasyonlarla birlikte de uygun olabilir, bu nedenle hücre sayısını artırmak en iyisidir Bu vakalarda immüno çökeltme için kullanılmıştır Her deney için gerekli hücre sayısına ulaşmak için, dilimlenmiş lizatın daha küçük kısımları seyreltme tamponu içerisinde kromatin seyreltmeden önce bir araya toplanabilir.Bu protokol doğrudan DNA'ya bağlanmayan endojen proteinler üzerinde ChIP gerçekleştirmek üzere modifiye edilebilir. Bu durumda, protein-protein çapraz bağlayıcılarla ( örneğin dimetil adipimidat, DMA) ön fiksasyon gerekebilir (daha fazla bilgi için Ek B'ye bakınız). Kofaktörlerde ChIP'in başarılı bir performansı, daha önce bir biotin etiketi ile kaynaştırılmış aşırı ifade eden proteinler tarafından yapılmıştır. Bu durumda, protein streptavidin-konjuga ile saflaştırılmıştırTed manyetik boncuklar ve DMA ile ön fiksasyon yapıldı 22 .
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mükemmel teknik yardım için P. Käse ve T. Schmidt-Wöll'e minnettarız. Bu çalışma, DFG (Alman Araştırma Vakfı )'nın TRR81 ve Heisenberg programı (BO 1639 / 5-1), Freiburg'daki Max Planck Topluluğu ve EXC 294 ortak araştırması hükmü ve Cardio Pulmoner Sistem için Mükemmellik Kümesi tarafından desteklendi. (ECCPS), Giessen'de TB'ye
Materials
| Agilent High Sensitivity D5000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5593 | |
| Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5592 | |
| Agilent Tapestation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | |
| Covaris S220 AFA System | Covaris | 500217 | |
| dimethyl adipimidate (DMA) | Thermo Fisher Scientific | 20660 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Pan-Biotech | 1502-P121301 | |
| Formaldehyde (FMA) | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21980-032 | |
| Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| nProtein A Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5280-02 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Peptone primatone | Sigma-Aldrich | P4963-100G | |
| Phase Lock Gel Heavy 2 ml | 5 Prime | 2302830 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Roth | A156.2 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO | 14190-094 | |
| Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| Tube AFA Fiber & Cap | Covaris | 520081 |
References
- Rothenberg, E. V. The chromatin landscape and transcription factors in T cell programming. Trends Immunol. 35 (5), 195-204 (2014).
- Zhang, J. A., Mortazavi, A., Williams, B. A., Wold, B. J., Rothenberg, E. V. Dynamic transformations of genome-wide epigenetic marking and transcriptional control establish T cell identity. Cell. 149 (2), 467-482 (2012).
- Cauchy, P., et al. Dynamic recruitment of Ets1 to both nucleosome-occupied and -depleted enhancer regions mediates a transcriptional program switch during early T-cell differentiation. Nucl Acids Res. 44 (8), 3567-3585 (2016).
- Koch, F., et al. Transcription initiation platforms and GTF recruitment at tissue-specific enhancers and promoters. Nat Struct Mol Biol. 18 (8), 956-963 (2011).
- Pekowska, A., et al. H3K4 tri-methylation provides an epigenetic signature of active enhancers. EMBO J. 30 (20), 4198-4210 (2011).
- Vanhille, L., et al. High-throughput and quantitative assessment of enhancer activity in mammals by CapStarr-seq. Nat Commun. 6, 6905 (2015).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
- Ostuni, R., et al. Latent enhancers activated by stimulation in differentiated cells. Cell. 152 (1-2), 157-171 (2013).
- Giaimo, B. D., Oswald, F., Borggrefe, T. Dynamic chromatin regulation at Notch target genes. Transcription. 8 (1), 61-66 (2017).
- Liefke, R., et al. Histone demethylase KDM5A is an integral part of the core Notch-RBP-J repressor complex. Genes Dev. 24 (6), 590-601 (2010).
- Jung, C., Mittler, G., Oswald, F., Borggrefe, T. RNA helicase Ddx5 and the noncoding RNA SRA act as coactivators in the Notch signaling pathway. Biochim Biophys Acta. 1833 (5), 1180-1189 (2013).
- Oswald, F., et al. A phospho-dependent mechanism involving NCoR and KMT2D controls a permissive chromatin state at Notch target genes. Nucl Acids Res. 44 (10), 4703-4720 (2016).
- Arrigoni, L., et al. Standardizing chromatin research: a simple and universal method for ChIP-seq. Nucl Acids Res. 44 (7), e67 (2016).
- Essen, D., Dullforce, P., Brocker, T., Gray, D. Cellular interactions involved in Th cell memory. J Immunol. 165 (7), 3640-3646 (2000).
- White, J., et al. Two better cell lines for making hybridomas expressing specific T cell receptors. J Immunol. 143 (6), 1822-1825 (1989).
- Ghisletti, S., et al. Identification and characterization of enhancers controlling the inflammatory gene expression program in macrophages. Immunity. 32 (3), 317-328 (2010).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Rothbart, S. B., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
- Fenouil, R., et al. CpG islands and GC content dictate nucleosome depletion in a transcription-independent manner at mammalian promoters. Genome Res. 22 (12), 2399-2408 (2012).
- Hein, K., et al. Site-specific methylation of Notch1 controls the amplitude and duration of the Notch1 response. Sci Signal. 8 (369), ra30 (2015).
