Fare İskelet Kasılarından Tip I ve Tip II Perisitlerin İzolasyonu
Summary
Bu çalışma, tip I ve tip II perisitlerin iskelet kaslarından kolay ve aynı anda izolasyonuna olanak tanıyan bir FACS tabanlı protokolü açıklamaktadır.
Abstract
Perisitler perivasküler multipotent hücreler olup, farklı organlarda hatta aynı dokuda heterojenlik gösterirler. İskelet kaslarında, farklı moleküler belirteçleri ifade eden ve ayırdedici özelliklere sahip en az iki perisit alt popülasyonu (tip I ve tip II olarak adlandırılır) bulunur. NG2-DsRed ve Nestin-GFP çift transgenik fareler kullanılarak, tip I (NG2-DsRed + Nestin-GFP – ) ve tip II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) perisitler başarıyla izole edilmiştir. Bununla birlikte, bu çift transgenik farelerin mevcudiyeti bu saflaştırma yönteminin yaygın kullanılmasını engeller. Bu çalışma, tip I ve tip II perisitlerin iskelet kaslarından kolay ve aynı anda izolasyonuna izin veren alternatif bir protokolü açıklamaktadır. Bu protokol, floresanla aktive hücre ayırma (FACS) tekniğini kullanır ve Nestin-GFP sinyaliyle birlikte NG2 yerine PDGFRβ'yı hedef alır. İzolasyondan sonra, I ve ty yazınPe II pericyitler farklı morfolojilere sahiptir. Buna ek olarak, çift transgenik farelerden izole edilenler gibi bu yeni yöntemle izole edilen tip I ve tip II perisitler sırasıyla adipojenik ve miyojeniktir. Bu sonuçlar, bu protokolün perisit alt popülasyonlarını iskelet kaslarından ve muhtemelen diğer dokulardan izole etmek için kullanılabileceğini düşündürmektedir.
Introduction
Kas distrofisi şimdiye kadar etkili bir tedavisi olmayan bir kas dejeneratif bozukluğudur. Doku yenilenmesini teşvik eden terapilerin gelişimi daima büyük ilgi gördü. Hasar sonrası doku rejenerasyonu ve onarımı yerleşik kök hücrelere / progenitör hücrelere bağlıdır 1 . Uydu hücreleri, kas yenilenmesine 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 katkıda bulunan miyojenik prekürsör hücrelere adanmıştır. Bununla birlikte, bunların klinik kullanımı, sınırlı göç ve enjeksiyondan sonra düşük hayatta kalma oranlarının yanı sıra , in vitro amplifikasyon sonrasında azalmış farklılaşma yetenekleri nedeniyle engellenmektedir 8 , 9 , 10 , 11 . Satelli'ye ek olarakIskelet kasları, trombosit türevi büyüme faktörü reseptör-beta (PDGFRp) -pozitif interstisyel hücreler gibi miyojenik potansiyeli 12 , 13 , 14 , 15 , 16 olan birçok hücre popülasyonunu da içerir. Kas türevi PDGFRβ + hücrelerinin, miyojenik hücrelere farklılaşabildiklerini ve kas patolojisini geliştirdiklerini ve 14 , 17 , 18 , 19 , 20 nolu fonksiyonları yerine getirebildiklerini gösteren kanıtlar vardır. PDGFRβ çoğunlukla pluripotik 22 , 23 olan perivasküler hücreler olan perisitleri 21 işaret eder. PDGFRβ'ya ilaveten, Neuron-Glial 2 (NG2) ve CD146 da dahil olmak üzere birçok diğer belirteçler, iPerisitleri dentify 21 . Bununla birlikte, bu belirteçlerin hiçbirinin çevreye özgü olmadığına dikkat edilmelidir. Son çalışmalar, tip I ve tip II olarak adlandırılan, farklı moleküler belirteçleri ifade eden ve farklı fonksiyonlar 19 , 24 , 25 gösteren kas perisitlerinin iki alt türünü ortaya çıkarmıştır. Biyokimyasal olarak, tip I perisitler NG2 + Nestin – iken, tip II perisitler NG2 + Nestin + 19 , 24'tür. Fonksiyonel olarak, tip I perisitler adipogenik farklılaşmaya maruz kalabilirler, yağ birikimi ve / veya fibrozise katkıda bulunurlar, oysa tip II perisitler miyojenik yol boyunca ayırt ederek kas yenilenmesine katkıda bulunurlar 19 , 24 , 25 . Bu sonuçlar şunu göstermektedir: (1) tip I perisitler bYağlı dejeneratif bozuklukların / fibrozun tedavisinde hedeflenen ve (2) tip II perisitlerin, kas distrofisi için büyük terapötik potansiyele sahip olduklarını göstermiştir. Bu popülasyonların daha fazla araştırılması ve karakterizasyonu, tip I ve tip II perisitlerin yüksek saflıkta ayrılmasını sağlayan bir izolasyon protokolü gerektirir.
Şu anda, perisit alt popülasyonlarının izolasyonu NG2-DsRed ve Nestin-GFP çift transjenik fareler 19 , 24'e dayanmaktadır. NG2-DsRed farelerin mevcudiyeti ve çoğu NG2 antikorunun kalitesi, bu yöntemin yaygın kullanımını sınırlar. Tüm NG2 + perisitlerinin ayrıca 19 , 20 , 24 iskelet kaslarındaki PDGFRβ'yı eksprese ettiği göz önüne alındığında, percyit'lerin izolasyonu ve alt popülasyonları için NG2'nin PDGFRβ ile değiştirilebileceği hipotezi altındayız. Bu çalışma, FACS tabanlı bir protokolü tanımlamaktadır.PDGFRβ boyama ve Nestin-GFP sinyalini kullanır. Bu yöntem araştırmacılar için daha az talepkar, çünkü: (1) NG2-DsRed fonunu gerektirmez ve (2) iyi karakterize edilmiş ticari olarak temin edilebilir PDGFRβ antikorlarını kullanır. İlaveten, tip I ve tip II perisitlerin yüksek saflıkta eşzamanlı olarak izole edilmesini sağlar ve bu perisit alt popülasyonlarının biyolojik ve terapötik potansiyelleri hakkında daha fazla araştırma yapılmasına izin verir. Saflaştırmanın ardından, bu hücreler kültürde yetiştirilebilir ve morfolojileri görselleştirilebilir. Bu çalışma aynı zamanda, çift transgenik farelerden saflaştırılanlar gibi bu yöntemi kullanarak izole edilen tip I ve tip II perisitlerin sırasıyla adipojenik ve miyojenik olduğunu göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Perisitler kılcal damarların 21 , 26 abluminal yüzeyinde bulunan çok-enerjili perivasküler hücreler 22 , 23'tür . İskelet kaslarında, perisitler adipogenik ve / veya miyojenik yolaklarda 19 , 20 , 24 arasında ayrım yapabilir. Son çalışmalar, farklı markör ekspresyonu ve belirgin farklılaşma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, kısmen Myotonic Distrofi Vakfı (MDF-FF-2014-0013) ve Amerikan Kalp Derneği'nden (16SDG29320001) Bilim İnsanı Geliştirme Hibesi'nden bir Fon A Üyesi Ödülüyle desteklendi.
Materials
| Cell Sorter | Sony | SH800 | |
| Automatic Setup Beads | Sony | LE-B3001 | |
| DMEM | Gibco | 11995 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Pericyte Growth Medium | ScienCell | 1201 | |
| MSC Basal Medium (Mouse) | Stemcell Technologies | 5501 | |
| Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse) | Stemcell Technologies | 5503 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004176 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| PDL | Sigma | P6407 | |
| PDGFRβ-PE Antibody | eBioscience | 12-1402 | |
| Perilipin Antibody | Sigma | P1998 | |
| S-Myosin Antibody | DSHB | MF-20 | |
| Alexa 555-anti-rabbit antibody | ThermoFisher Scientific | A-31572 | |
| Alexa 555-anti-mouse antibody | ThermoFisher Scientific | A-31570 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| HEPES | Gibco | 15630 | |
| EDTA | Fisher | BP120 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A661 | |
| KHCO3 | Fisher Scientific | P184 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 18G Needles | BD | 305196 | |
| 10ml Serological Pipette | BD | 357551 |
References
- Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine. Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Relaix, F., Zammit, P. S. Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage. Development. 139 (16), 2845-2856 (2012).
- von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Kuang, S., Charge, S. B., Seale, P., Huh, M., Rudnicki, M. A. Distinct roles for Pax7 and Pax3 in adult regenerative myogenesis. J Cell Biol. 172 (1), 103-113 (2006).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Morgan, J. E., Pagel, C. N., Sherratt, T., Partridge, T. A. Long-term persistence and migration of myogenic cells injected into pre-irradiated muscles of mdx mice. J Neurol Sci. 115 (2), 191-200 (1993).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Partridge, T. A. Invited review: myoblast transfer: a possible therapy for inherited myopathies. Muscle Nerve. 14 (3), 197-212 (1991).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).
- Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells Dev. 17 (4), 653-667 (2008).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
- Mitchell, K. J., et al. Identification and characterization of a non-satellite cell muscle resident progenitor during postnatal development. Nat Cell Biol. 12 (3), 257-266 (2010).
- Pannerec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development. 140 (14), 2879-2891 (2013).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9 (3), 255-267 (2007).
- Kostallari, E., et al. Pericytes in the myovascular niche promote post-natal myofiber growth and satellite cell quiescence. Development. 142 (7), 1242-1253 (2015).
- Birbrair, A., et al. Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation. Stem Cells Dev. 22 (16), 2298-2314 (2013).
- Yao, Y., Norris, E. H., Mason, C. E., Strickland, S. Laminin regulates PDGFRbeta(+) cell stemness and muscle development. Nat Commun. 7, 11415 (2016).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Dore-Duffy, P. Pericytes: pluripotent cells of the blood brain barrier. Curr Pharm Des. 14 (16), 1581-1593 (2008).
- Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (5), 613-624 (2006).
- Birbrair, A., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Res. 10 (1), 67-84 (2013).
- Gautam, J., Nirwane, A., Yao, Y. Laminin differentially regulates the stemness of type I and type II pericytes. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 28 (2017).
- Birbrair, A., et al. Pericytes: multitasking cells in the regeneration of injured, diseased, and aged skeletal muscle. Front Aging Neurosci. 6, 245 (2014).
