Isolamento de Pericitos Tipo I e Tipo II de Músculos Esqueléticos de Rato

A distrofia muscular é uma desordem músculo-degenerativa que não tem nenhum tratamento eficaz até agora. O desenvolvimento de terapias que promovem a regeneração de tecidos tem sido sempre de grande interesse. A regeneração e reparação dos tecidos após os danos dependem das células estaminais / células progenitoras residentes ¹ . As células satélites são células precursoras miogénicas comprometidas que contribuem para a regeneração muscular ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7} . O seu uso clínico, no entanto, é dificultado pela sua migração limitada e baixa taxa de sobrevivência após a injecção, bem como pela sua diminuição da capacidade de diferenciação após a amplificação in vitro ^{8 , 9 , 10 , 11} . Além do satelliTe células, os músculos esqueléticos também contêm muitas outras populações de células com potencial miogénico ^{12 , 13 , 14 , 15 , 16} , tais como as células intersticiais positivas ao receptor de factor de crescimento derivado de plaquetas beta (PDGFRp). Há evidências que demonstram que as células PDGFRβ ⁺ derivadas de músculo são capazes de se diferenciar em células miogênicas e melhorar a patologia e a função muscular ^{14 , 17 , 18 , 19 , 20} . O PDGFRβ rotula predominantemente os pericitos ²¹ , que são células perivasculares com pluripotência ^{22 , 23} . Além de PDGFRβ, muitos outros marcadores, incluindo Neuron-Glial 2 (NG2) e CD146, também são usados ​​para iDentify pericytes ²¹ . Deve-se notar, no entanto, que nenhum desses marcadores é pericítico-específico [ ^21] . Estudos recentes revelaram dois subtipos de pericitos musculares, chamados de tipo I e tipo II, que expressam marcadores moleculares diferentes e exercem funções distintas ^{19 , 24 , 25} . Bioquimicamente, os pericitos do tipo I são NG2 ⁺ Nestin ^– , enquanto os pericídios do tipo II são NG2 ⁺ Nestin ^{+ 19 , 24} . Funcionalmente, os pericitos tipo I podem sofrer diferenciação adipogênica, contribuindo para acúmulo de gordura e / ou fibrose, enquanto que os pericitos de tipo II podem se diferenciar ao longo da via miogênica, contribuindo para a regeneração muscular ^{19 , 24 , 25} . Estes resultados demonstram que: (1) os pericitos de tipo I podem bE alvo no tratamento de transtornos degenerativos gordos / fibrose, e (2) pericitos de tipo II têm grande potencial terapêutico para a distrofia muscular. Outras investigações e caracterização destas populações requerem um protocolo de isolamento que permita a separação dos pericitos tipo I e tipo II com alto grau de pureza.

Atualmente, o isolamento de subpopulações pericíticas depende de camundongos duplamente transgênicos NG2-DsRed e Nestin-GFP 19,24. A disponibilidade de ratinhos NG2-DsRed ea qualidade da maioria dos anticorpos NG2 limitam o uso generalizado deste método. Dado que todos os pericitos NG2 ⁺ também expressam PDGFRβ nos músculos esqueléticos ^{19 , 20 , 24} , hipótese de que NG2 pode ser substituído por PDGFRβ para o isolamento de pericitos e suas subpopulações. Este trabalho descreve um protocolo baseado em FACS queUtiliza a coloração PDGFRβ e o sinal Nestin-GFP. Este método é menos exigente para os investigadores porque: (1) não requer o fundo NG2-DsRed e (2) utiliza anticorpos PDGFRβ comercialmente disponíveis, que são bem caracterizados. Além disso, permite o isolamento simultâneo de pericitos tipo I e tipo II com elevada pureza, permitindo uma investigação mais aprofundada da biologia e potencial terapêutico destas subpopulações de pericitos. Após purificação, estas células podem ser cultivadas em cultura, e as suas morfologias podem ser visualizadas. Este trabalho também mostra que os pericitos tipo I e tipo II isolados usando este método, como os purificados a partir de camundongos duplamente transgênicos, são adipogênicos e miogênicos, respectivamente.