Summary

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout'larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

Published: June 16, 2017
doi:

Summary

Somatik hücre dizilerini genetik olarak manipüle etme becerisindeki son gelişmeler, temel ve uygulamalı araştırmalar için büyük potansiyele sahiptir. Burada, CRISPR / Cas9'un ürettiği nakavt üretimi ve seçilebilir işaretlerin kullanılıp kullanılmadığı memeli hücre hatlarında tarama için iki yaklaşım sunuyoruz.

Abstract

CRISPR / Cas9 genom mühendisliği sistemi, az çaba sarf ederek hassas genom düzenlemesine izin vererek biyolojiye devrim yarattı. Spesifikliği kazandıran tek bir rehber RNA (sgRNA) yardımıyla Cas9 proteini, her iki DNA zincirini hedeflenen lokusta parçalamaktadır. DNA kopması homolog olmayan bitiş katılma (NHEJ) veya homoloji yönelimli onarım (HDR) tetikleyebilir. HDR, daha büyük ve daha hassas pertürbasyonlara izin verirken, NHEJ, çerçeve kayması mutasyonlarına yol açan küçük delesyonlar veya eklemeler başlatabilir. Burada, çökertilmiş hücre hatlarının üretilmesi için protokolleri, kurulu CRISPR / Cas9 yöntemlerini downstream seçim / tarama için iki seçenek ile birleştirerek sunuyoruz. NHEJ yaklaşımı, tek bir sgRNA kesim bölgesini ve seleksiyondan bağımsız taramayı kullanır; burada, protein üretiminin nokta imünoblotuyla yüksek verimli bir şekilde değerlendirildiği yerdir. HDR yaklaşımı ilgi geni boyunca uzanan iki sgRNA kesim bölgesini kullanır. Sağlanan HDR şablonuyla birlikte bu yöntem silme gerçekleştirebilirEklenebilen seçilebilir direnç işaretleyicisinin yardımıyla, onlarca kb arasında değişir. Her bir yöntemin uygun uygulamaları ve avantajları tartışılmıştır.

Introduction

Kararlı genetik değişiklikler, verimlilik ve süre bakımından değişken olabilen geçici hücresel pertürbasyon yöntemlerine göre bir avantaj sağlar. Genomik düzenleme, çinko parmak nükleazları 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , transkripsiyon aktivatörü benzeri efektör nükleazları (TALEN'ler) 6 , 7 , 8 , 9 gibi hedefe spesifik nükleazların gelişimi nedeniyle son yıllarda giderek yaygınlaşmaktadır. Ve kümelenmiş, düzenli olarak aralıklı kısa palindromik tekrarlardan (CRISPR) türemiş RNA yönlendirmeli nükleazlar 10 .

CRISPR / Cas9 düzenleme makineleri bakterilerin ve arkeaların viral enfeksiyonlara karşı savunmak için kullandıkları bağışıklık sisteminden adapte edilmiştirAss = "xref"> 11 , 12 , 13 . Bu süreçte, işgalci viral dizinin kısa, 20-30 nt fragmanları, tekrar eden birimler 14 , 15 tarafından çevrelenen "aralayıcılar" olarak genomik bir lokasyona dahil edilir. Ardından transkripsiyon ve RNA işleme, bir aktive edici crRNA 17 (tracrRNA) ile efektör Cas9 endonükleazı birleştiren küçük CRISPR ilişkili RNA'lar16 (crRNA'lar) üretir. Dolayısıyla, crRNA'lar Cas9 hedeflemesine özgüllük sağlar, kompleksi tamamlayıcı viral DNA dizilerini bölmeye yönlendirir ve diğer enfeksiyonları önler 18,19. Hedeflenen DNA'daki herhangi bir "protospacer" sekans, kısa bir protospazere komşu motife (PAM) doğrudan 5 ', S. pyogenes Cas9 durumunda ise NGG olduğu sürece, crRNA'nın kaynağı olarak görev yapabilir <sUp class = "xref"> 20. Ev sahibinin CRISPR lokusu içindeki boşluk yakınında PAM sekansının olmaması, benliğin kendisi ile ben olmayan arasındaki ayrımı yaparak, ev sahibinin hedeflenmesini engeller. Evrenselliği ve esnekliği nedeniyle, bu biyolojik sistem genomik düzenleme için güçlü bir şekilde adapte edilmiştir, böylelikle hemen hemen her PAM bitişik DNA sitesi hedeflenebilir. Bu sürümde, başka bir değişiklik, crRNA ve tracRNA'yı Cas9 protein 21'e yüklenen tek bir rehber RNA (sgRNA) bileşenine kaynaştırdı.

Ökaryotik hücrelerde Cas9 ve bir sgRNA ekspresyonu üzerine Cas9 proteini, her iki DNA kolunu hedeflenen lokusta parçalamaktadır. Uygun homolog bir dizinin yokluğunda hücre bu kopuşu tipik olarak küçük delesyonlar veya nadiren eklemeler başlatan homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) 22 , 23 , 24 aracılığıyla tespit eder. Bir açık hedefleme yaparkenOkuma çerçevesi, onarım muhtemelen işlevsel olmayan bir protein ürünü üreten bir translasyonel çerçeve kaymasına yol açar. Aksine, geniş homoloji bölgelerine sahip bir dışsal şablon ile sağlandığında, hücre homolog yöneltilmiş onarım 25 , 26 ile çift iplikçik kırılmasını sabitleyebilir. Bu yol, genomda daha büyük hassas silme, değiştirme veya eklemeye izin verir ve ölebilir seçim işaretleri 27'nin eklenmesi ile birlikte.

Burada, bu iki CRISPR / Cas9 yöntemlerinden biri ile nakavt hücre hatları üretmek için protokoller sunuyoruz ( Şekil 1A ). NHEJ yaklaşımı, tek bir sgRNA kesim bölgesini ve seçiciden bağımsız taramayı kullanır ve bu nedenle çok fazla ön hazırlık gerektirir. Bu yöntemi kullanırken, transkriptin 5 'ucundaki eksonları tamamlayan ve en iyi nakavt üreten kılavuz RNA'lar tasarlanmalıdır. Modifikattan beriBu durumda iyonların genoma küçük olması, nakavt klonlarının taranması, protein ürününün yüksek verimli bir şekilde değerlendirildiği nokta lekelerine dayanıyor. Bir örnek olarak ELAV benzeri 1 protein (ELAVL1) nakavt hatları neslini kullanırız. İkinci yaklaşım, homoloji yönelimli onarım (HDR) üzerine kuruludur ve onlarca kb silinmesine izin vererek ilgi geni veya bölgeyi kapsayan iki sgRNA kesim bölgesini kullanır. Yarılma bölgelerinin yanındaki iki homoloji bölgesine sahip bir plazmid, nakavt üretiminin verimliliğini arttıran seçilebilir bir direnç markeri tanıtan bir değiştirme şablonu ( Şekil 1B ) sağlar. Bu yöntem, uygun şekilde tasarlanmış homoloji kollarıyla gen modifikasyonlarını başlatmak için uyarlanabilir. Bu durumda, yeni bir DNA parçasının entegrasyonu PCR'ye dayalı taramaya izin verir ( Şekil 1C ). Burada, örnek olarak Pumilio RNA bağlayıcı aile üyesi 2 (PUM2) nakavt hatları neslini kullanıyoruz.

Protocol

1. İstenilen Silinme Çevresindeki Homoloji Bölgelerinin Belirlenmesi NOT: Yalnızca seçim temelli düzenleme kullanılıyorsa gereklidir. HDR şablonunda homoloji kolları olarak görev yapacak istenen silme yerinin her iki tarafında başlangıçta 1.5-2 kb olan iki bölge seçin ( Şekil 1A ). Klonlamayı kolaylaştırmak için her iki zincirde (GGTCTC) BsaI tanıma sitelerinden yoksun bölgeler belirleyin. BsaI siteleri kaçınılmazsa alternat…

Representative Results

ELAVL1 nakavt hatlarının üretilmesi için sağlam bir antikor mevcuttu, bu nedenle tek sgRNA'lar ( Şekil 1A , solda) kullanılarak düzenleme, ardından nokta immünoblot uygulandı. Elde edilen klonlarda verimlilikleri karşılaştırmak ve hedef etkileri dışarıda bırakmak için bağımsız olarak üç sgRNA transfekte edildi. Hücre lizatlarını, iki nitroselüloz zar üzerine klonal popülasyondan toplayıp blotladıktan sonra lekeler hem ELA…

Discussion

CRISPR / Cas9 sistemi, diğer geçici manipülasyon yöntemlerine daha tutarlı bir alternatif sağlayan stabil genomik modifikasyonların verimli bir şekilde oluşturulmasına izin vermiştir. Burada, memeli hücre hatlarında CRISPR / Cas9 gen nakavtın hızlı tanımlanması için iki yöntem sunduk. Her iki yöntem de çok az hücresel malzeme gerektirir, bu nedenle test, klonal kültüre ait erken safhalarda yapılabilir, zamandan ve reaktiflerden tasarruf edilebilir. Her iki yöntemin verimliliğini artırmak iç…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, deneysel yardım için Gissell Sanchez, Megan Lee ve Jason Estep'i ve reaktifleri paylaşmak için Weifeng Gu ve Xuemei Chen'i onaylamak istiyorlar.

Materials

Competent E. coli cells
plasmid prep kit
pSpCas9(BB) plasmid Addgene 42230 Ran et al 2013, cloning sgRNAs
BbsI enzyme ThermoFisher FD1014 Ran et al 2013, cloning sgRNAs
T7 DNA ligase NEB M0318L Ran et al 2013, cloning sgRNAs
Tango Buffer ThermoFisher BY5 Ran et al 2013, cloning sgRNAs
PlasmidSafe exonuclease Epicentre E3105K Ran et al 2013, cloning sgRNAs
Q5 hot start high fidelity polymerase NEB M0494A HA amplification
pUC19-BsaI Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion
pGolden-Neo Addgene 51422 Resistance cassette
pGolden-Hygro Addgene 51423 Resistance cassette
BsaI enzyme NEB R3535S Homology arm contruction
T7 DNA ligase NEB M0318L
PlasmidSafe exonuclease Epicentre E3105K
Toothpicks bacterial PCR
Taq polymerase bacterial colony PCR
HEK293 human cells
DMEM Corning 10-013-CV
FBS Corning MT35010CV
Penicillin-Strep (opt.) Gibco 15140-122
6 well plates BioLite 12556004
TransIT-LTI Transfection Reagent Mirus MIR2300 for lipofection only
Opti-MEM ThermoFisher 31985062 for lipofection only
G418 (Neomycin) Sigma Aldrich A1720-5G
Hygromycin Sigma Aldrich H3274-250MG
96 well plates ThermoFisher 12556008
Passive Lysis Buffer, 5x Promega
1xSDS loading buffer recipe decribed in protocol
Nitrocellulose Membrane Bio-Rad 162-0115
TBST recipe decribed in protocol
Dehydrated milk
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ThermoFisher 34075 for HRP-conjugated secondary antibodies
Extracta DNA prep for PCR Quantabio 95091-025
KOD polymerase Novagen 71316

References

  1. Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).
  2. Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).
  3. Bibikova, M., et al. Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases. Mol Cell Biol. 21 (1), 289-297 (2001).
  4. Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
  5. Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Mol Cell Biol. 23 (10), 3558-3565 (2003).
  6. Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).
  7. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
  8. Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
  9. Christian, M., et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics. 186 (2), 757-761 (2010).
  10. Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69, 209-228 (2015).
  11. Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
  12. Karginov, F. V., Hannon, G. J. The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea. Mol Cell. 37 (1), 7-19 (2010).
  13. Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
  14. Mojica, F. J., Diez-Villasenor, C., Garcia-Martinez, J., Soria, E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).
  15. Pourcel, C., Salvignol, G., Vergnaud, G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology. 151 (Pt 3), 653-663 (2005).
  16. Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
  17. Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471 (7340), 602-607 (2011).
  18. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
  19. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).
  20. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
  21. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  22. Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
  23. Guirouilh-Barbat, J., et al. Impact of the KU80 pathway on NHEJ-induced genome rearrangements in mammalian cells. Mol Cell. 14 (5), 611-623 (2004).
  24. Moore, J. K., Haber, J. E. Cell cycle and genetic requirements of two pathways of nonhomologous end-joining repair of double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 16 (5), 2164-2173 (1996).
  25. Liang, F., Han, M., Romanienko, P. J., Jasin, M. Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5172-5177 (1998).
  26. Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).
  27. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  28. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
  29. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  30. Luo, Y., Lin, L., Bolund, L., Sorensen, C. B. Efficient construction of rAAV-based gene targeting vectors by Golden Gate cloning. Biotechniques. 56 (5), 263-268 (2014).
  31. Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
  32. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
  33. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).

Play Video

Cite This Article
Sternburg, E. L., Dias, K. C., Karginov, F. V. Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (124), e55903, doi:10.3791/55903 (2017).

View Video