Selezione-dipendente e generazione indipendente di CRISPR / Cas9-mediata Gene Knockouts nelle cellule di mammiferi

Le alterazioni genetiche stabili offrono un vantaggio rispetto ai metodi transitori di perturbazione cellulare, che possono essere variabili nella loro efficienza e durata. L'editing genomico è diventato sempre più comune negli ultimi anni a causa dello sviluppo di nucleasi specifiche di target, quali le nucleasi di zinco-dito ^{, 1 , 2 , 3 , 4 , 5} , nucleasi efficace (TALEN) simili all'attivatore di trascrizione ^{6 , 7 , 8 , 9} E nucleasi guidate da RNA derivate dal sistema di ripetizioni palindromiche corte (CRISPR) regolarmente interspaziate in cluster ¹⁰ .

La macchina di montaggio CRISPR / Cas9 è adattata da un sistema immunitario che batteri e archea usano per difendersi dalle infezioni viraliAss = "xref"> 11 ^{, 12 , 13} . In questo processo, brevi, 20-30 nt frammenti di sequenza virale invasiva sono incorporati in un locus genomico come "distanziatori" fiancheggiati da unità ripetitive ^{14 , 15} . La successiva trascrizione e l'elaborazione di RNA generano piccoli RNA ¹⁶ associati a CRISPR (crRNAs) che, insieme a un crRNA trans-attivante ¹⁷ (tracrRNA), si riuniscono con l'endonucleasi efficace Cas9. I crRNA forniscono quindi la specificità per il targeting di Cas9, guidando il complesso per sequestrare sequenze DNA complementari virali e prevenire ulteriori infezioni ^{18 , 19} . Ogni sequenza "protospacer" nel DNA mirato può servire come fonte del CRRNA, purché sia ​​direttamente 5 'a un breve motivo adiacente protospacer (PAM), NGG nel caso di S. pyogenes Cas9 <sUp class = "xref"> 20. L'assenza della sequenza PAM vicino al distanziatore nel loco CRISPR dell'host distingue tra auto e non-auto, impedendo il targeting dell'host. A causa della sua universalità e flessibilità, questo sistema biologico è stato fortemente adattato per l'editing genomico, in modo che quasi tutti i siti adiacenti del PAM possano essere mirati. In questa versione, un'ulteriore modifica ha fuso la crRNA e la tracrRNA in un singolo componente RNA (sgRNA) guida che è caricato nella proteina Cas9 ²¹ .

Dopo l'espressione di Cas9 e di un sgRNA nelle cellule eucariotiche, la proteina Cas9 elimina entrambi i fili di DNA nel luogo di destinazione. In assenza di una regione adatta di sequenza omologa, la cella risolve questa rottura mediante l'adesione finale non omologica (NHEJ) ^{22 , 23 , 24} , che presenta tipicamente piccole delezioni o, raramente, inserzioni. Quando si punta ad un apertoLa riparazione probabilmente porta ad un frameshift traslatorio che produce un prodotto proteico non funzionale. Al contrario, quando è dotato di un modello esogeno con grandi regioni di omologia, la cellula può fissare la rottura a doppio filamento con la riparazione diretta dell'omologia ^{25 , 26} . Questo percorso consente di eliminazioni, sostituzioni o inserzioni nel genoma più precise, accoppiato con l'introduzione di marcatori di selezione accisa ²⁷ .

Qui presentiamo i protocolli per la generazione di linee di cellule di knockout mediante uno di questi due metodi CRISPR / Cas9 ( Figura 1A ). L'approccio NHEJ utilizza un unico sito taglio sgRNA e uno screening indipendente dalla selezione, e quindi richiede una piccola preparazione anticipata. Quando si utilizza questo metodo, devono essere progettati i RNA complementari agli esoni prossimi all'estremità 5 della trascrizione, che sono più probabili a produrre un eliminazione. Dal momento che il modificatoGli ioni al genoma in questo caso sono piccoli, lo screening per i cloni di knockout si basa su macchie dot, dove il prodotto proteico viene valutato in modo ad alto rendimento. Ad esempio, usiamo la generazione di linee di eliminazione di ELAV come proteine ​​1 (ELAVL1). Il secondo approccio si basa sulla riparazione diretta dell'omologia (HDR) e utilizza due siti di taglio sgRNA che spaziano il gene o regione di interesse, consentendo la cancellazione di decine di kb. Un plasmide con due regioni di omologia che fiancheggiano i siti di scissione fornisce un modello di sostituzione ( Figura 1B ), introducendo un marker di resistenza selezionabile che aumenta l'efficienza della generazione di eliminazione. Questo metodo può anche essere adattato per introdurre modifiche geniche con armi di omologia adeguatamente progettate. In questo caso, l'integrazione di un nuovo frammento di DNA consente di effettuare uno screening basato su PCR ( Figura 1C ). Ad esempio, usiamo la generazione di linee di eliminazione di Pumilio RNA 2 (PUM2).