Yeni Bir Dünyadan Rekombinant Virüsün Kurtarılması ve Karakterizasyonu Zika Virüsü Bulaşıcı Klon
Summary
Bu protokol, iki-plazmid bulaşıcı bir cDNA klonundan bulaşıcı Zika virüsünün iyileşmesini tanımlıyor.
Abstract
Enfeksiyöz cDNA klonları bir virüsün genetik manipülasyonuna izin verir, böylece aşılar üzerinde çalışma, patogenez, replikasyon, bulaşma ve viral evrimi kolaylaştırır. Burada Zika virüsü (ZIKV) için şu anda Amerika'da patlayıcı bir salgına neden olan bulaşıcı bir klonun yapımını anlatıyoruz. Flavivirüs kaynaklı plazmidlerle sıkça görülen bakterilere toksisiteyi önlemek için genomu NS1 geninde ayıran ve mutasyonsuz başarıyla kurtarılamayan tam uzunluktaki yapılardan daha kararlı olan iki plazmid sistemi ürettik. İki parçaya katılmak için sindirim ve ligasyondan sonra, T7 RNA polimeraz ile in vitro transkripsiyon ile tam uzunluktaki viral RNA üretilebilir. Transkribe RNA'nın hücrelere elektroporasyonundan sonra sırasıyla farelerde ve sivrisineklerde benzer in vitro büyüme kinetikleri ve in vivo virülans ve enfeksiyon fenotiplerini sergileyen virüs bulunmuştur.
Introduction
Zika virüsü (ZIKV; Aile Flaviviridae : Genus Flavivirus ), 2013-14 yılları arasında Brezilya'ya gelen sivrisinek taşıyan bir flavivirüs olup, daha sonra Amerika Birleşik Devletleri'nde yaygınlaşan ateşli bir hastalık patlamasıyla ilişkilendirilmiştir 1 . Buna ek olarak, ZIKV, yetişkinlerde Guillain-Barré sendromu ve fetüsler ve yenidoğanlarda mikrocefali gibi ağır hastalık sonuçlarıyla bağlantılıdır2. Batı yarımkürede hızla yayılmadan önce ZIKV hakkında pek az şey biliniyordu. Bu, moleküler araçların eksikliğini içeriyordu, bu yüzden mekanistik araştırmayı engelledi. Bulaşıcı cDNA klonları gibi virüsler için moleküler araçlar aşı ve antiviral terapötik gelişmeyi kolaylaştırır ve farklı viral patogenez, bağışıklık yanıtı ve viral evrim ile ilgili viral genetik faktörlerin değerlendirilmesine izin verir.
Flavivirüs bulaşıcı klonların bakterilerde cr nedeniyle oldukça kararsız olduğu bilinmektedirGenomlarında bulunan yptik prokaryotik hızlandırıcılar 3 . Bu sorunu hafifletmek için çeşitli yaklaşımlar kullanılmıştır; Virütik dizilerin 4 üst akışında tandem tekrarların yerleştirilmesi, varsayılan prokaryotik promoter dizilerinin 5 mutasyonu, genomun birden çok plazmid 6'ya bölünmesi, düşük kopya sayı vektörleri (bakteri yapay kromozomlar dahil) 7,8 ve viral genomda intronların sokulması da dahil olmak üzere 9 . ZIKV için modifikasyonsuz bir tam uzunluklu sistem tanımlanmıştır; Bununla birlikte, bu klonun hücre kültüründe ve farelerde zayıfladığı görülmüştür. Diğer gruplar ZIKV genomuna intronlar tasarladılar ve in vitro memeliler hücrelerinde enfeksiyöz virüsün üretilmesi için eklenebilen bakterilerdeki istikrarsız dizilerin bozulmasına izin verdi 11, 12 . Ek olarak, ZIKV 13'ün prototip MR766 suşunu kurtarmak için İnfeksiyöz-Subgenomik-Amplikon başlıklı bir PCR tabanlı sistem başarıyla kullanılmıştır. Burada açıklanan yaklaşım, yabancı sekanslara ihtiyaç duymamakta, daha önce sarı humma 6 , dang 14 , 15 ve Batı Nil virüsleri 16 ile başarıyla kullanılan çok sayıda plazmid kullanarak yüksek instabilite bölgesinde genomu bozmaktadır. Dahası, viral genomik uçtaki hepatit D ribozim dizisinin eklenmesi, bir doğrusallaştırma bölgesi eklenmesine gerek kalmadan otantik bir 3 'ucunun oluşturulmasını kolaylaştırır. Buna ek olarak, her iki plazmid, herhangi bir artık toksisite 17 azaltmak için düşük kopya sayısı vektör (pACYC177, hücre başına ~ 15 kopya) inşa edilmiştir. Geri kazanılan virüs,Hem anne hem de böceklerden türeyen çeşitli hücre tiplerini içeren 8 hücre hattındaki in vitro büyüme eğrilerinde ebeveyn virüs bulaştırdı ve farelerde aynı patojenik profilleri, sivrisineklerde enfeksiyon, yayılım ve iletim oranlarını sergiledi.
Burada, bulaşıcı klon plasmidlerin büyümesini , in vitro olarak tam uzunlukta viral RNA (viral genom) üretmek ve hücre kültüründe bulaşıcı virüsün nasıl toplanacağını açıklayan bir protokol açıklanmaktadır. İlk olarak bakterilerdeki plazmidlerin çoğalmasını veya yuvarlanan daire amplifikasyonunu (RCA) kullanarak bakteri içermeyen amplifikasyonunu anlatacağız. Sonra, iki plazmitin nasıl sindirildiğini ve ardından tam uzunlukta virüs üretmek için birlikte bağlandığını gösteriyoruz. Son olarak, transkripsiyon RNA üretimini ve daha sonra Vero hücrelerine elektroporasyonunu, ardından geri kazanılan virüs titrasyonunu tarif ediyoruz ( Şekil 1 ). Açıklanan yaklaşım hızlıdır,Enfeksiyonlu virüs stoklarının 1-2 hafta içinde toparlanması.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Klon'dan türeyen virüsün karakterize edilmesine yardım ettikleri için Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic ve Claudia Rückert'e teşekkür etmek istiyorlar. Bu çalışma, Ulusal Allerji ve Enfeksiyon Hastalıkları Enstitüsü (NIH) tarafından hibe AI114675 (BJG) ve AI067380 (GDE) altındaki hibelerden kısmen desteklenmiştir.
Materials
| NEB Stable CompetentE. coli | New England BioLabs | C3040H | |
| Carbenicillin, Disodium Salt | various | ||
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4036 | |
| ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit | Zymo Research | D4202 | |
| SalI-HF | New England BioLabs | R3138S | 20,000 units/ml |
| NheI-HF | New England BioLabs | R3131S | 20,000 units/ml |
| ApaLI | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/ml |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | 20,000 units/ml |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | 20,000 units/ml |
| HindIII-HF | New England BioLabs | R3104S | 20,000 units/ml |
| illustra TempliPhi 100 Amplification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25640010 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 units/ml |
| Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England BioLabs | M0290S | 10,000 units/ml |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | 400,000units/mL |
| HiScribe T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs | E2065S | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| ECM 630 High Throughput Electroporation System | BTX | 45-0423 | Other machines are acceptable. |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma | L3147 | Can be homemade as well. |
| Terrific Broth | Sigma | T0918 | Can be homemade as well. |
| Petri Dish | Celltreat | 229693 | |
| Culture Tubes | VWR International | 60818-576 | |
| T75 flasks | Celltreat | 229340 | |
| T182 flasks | Celltreat | 229350 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| Tragacanth Powder | MP Bio | MP 104792 | |
| Crystal Violet | Amresco | 0528-1006 | |
| Ethanol Denatured | VWR International | BDH1156-1LP | |
| 6 well plate | Celltreat | 229106 | |
| 12 well plate | Celltreat | 229111 | |
| Sequencing Oligos | IDT | see table 1 | |
| Qubit 3.0 | ThermoFisher | Qubit 3.0 | other methods are acceptable. |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher | Q32850 | other methods are acceptable. |
| Qubit RNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32852 | other methods are acceptable. |
| Class II Biosafety Cabinet | Varies | N/A | This is necessary for live-virus work. |
References
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675C-686C (2016).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome–case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveill. 19 (9), (2014).
- Li, D., Aaskov, J., Lott, W. B. Identification of a cryptic prokaryotic promoter within the cDNA encoding the 5′ end of dengue virus RNA genome. PLoS One. 6 (3), e18197 (2011).
- Pu, S. Y., et al. A novel approach to propagate flavivirus infectious cDNA clones in bacteria by introducing tandem repeat sequences upstream of virus genome. J Gen Virol. 95 (Pt 7), 1493-1503 (2014).
- Pu, S. Y., et al. Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes. J Virol. 85 (6), 2927-2941 (2011).
- Rice, C. M., Grakoui, A., Galler, R., Chambers, T. J. Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation. New Biol. 1 (3), 285-296 (1989).
- Yun, S. I., Kim, S. Y., Rice, C. M., Lee, Y. M. Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus. J Virol. 77 (11), 6450-6465 (2003).
- Gualano, R. C., Pryor, M. J., Cauchi, M. R., Wright, P. J., Davidson, A. D. Identification of a major determinant of mouse neurovirulence of dengue virus type 2 using stably cloned genomic-length cDNA. J Gen Virol. 79 (Pt 3), 437-446 (1998).
- Johansen, I. E. Intron insertion facilitates amplification of cloned virus cDNA in Escherichia coli while biological activity is reestablished after transcription in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (22), 12400-12405 (1996).
- Shan, C., et al. An Infectious cDNA Clone of Zika Virus to Study Viral Virulence, Mosquito Transmission, and Antiviral Inhibitors. Cell Host Microbe. 19 (6), 891-900 (2016).
- Schwarz, M. C., et al. Rescue of the 1947 Zika Virus Prototype Strain with a Cytomegalovirus Promoter-Driven cDNA Clone. mSphere. 1 (5), (2016).
- Tsetsarkin, K. A., et al. A Full-Length Infectious cDNA Clone of Zika Virus from the 2015 Epidemic in Brazil as a Genetic Platform for Studies of Virus-Host Interactions and Vaccine Development. MBio. 7 (4), (2016).
- Gadea, G., et al. A robust method for the rapid generation of recombinant Zika virus expressing the GFP reporter gene. Virology. 497, 157-162 (2016).
- Kapoor, M., Zhang, L., Mohan, P. M., Padmanabhan, R. Synthesis and characterization of an infectious dengue virus type-2 RNA genome (New Guinea C strain). Gene. 162 (2), 175-180 (1995).
- Messer, W. B., et al. Development and characterization of a reverse genetic system for studying dengue virus serotype 3 strain variation and neutralization. PLoS Negl Trop Dis. 6 (2), e1486 (2012).
- Kinney, R. M., et al. Avian virulence and thermostable replication of the North American strain of West Nile virus. J Gen Virol. 87 (Pt 12), 3611-3622 (2006).
- Chang, A. C., Cohen, S. N. Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid. J Bacteriol. 134 (3), 1141-1156 (1978).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone. J Virol. 91 (1), (2017).
- Roberts, P. L., Lloyd, D. Virus inactivation by protein denaturants used in affinity chromatography. Biologicals. 35 (4), 343-347 (2007).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. (93), e52065 (2014).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone. J Virol. , (2016).
- Grubaugh, N. D., et al. Genetic Drift during Systemic Arbovirus Infection of Mosquito Vectors Leads to Decreased Relative Fitness during Host Switching. Cell Host Microbe. 19 (4), 481-492 (2016).
