Спасение и характеристика рекомбинантного вируса из нового мира Инфекционный клон вируса Зика

Вирус Zika (ZIKV; Family Flaviviridae : Genus Flavivirus ) – это флавивирус вируса комаров, который прибыл в Бразилию в 2013-14 годах и впоследствии был связан с массовой вспышкой фебрильной болезни, которая распространилась по всей Америке ¹ . Кроме того, ZIKV был связан с тяжелыми последствиями заболевания, такими как синдром Гийена-Барре у взрослых и микроцефалия у плодов и новорожденных ² . Мало что известно о ZIKV до его быстрого распространения в западном полушарии. Это включало отсутствие молекулярных инструментов, что препятствовало механистическим исследованиям. Молекулярные инструменты для вирусов, такие как клоны кДНК, способствуют развитию вакцины и антивирусных препаратов, а также позволяют оценить вирусные генетические факторы, связанные с дифференциальным вирусным патогенезом, иммунным ответом и эволюцией вируса.

Известно, что инфекционные клоны флавивируса очень нестабильны у бактерий из-за crВ их геномах присутствуют промотирующие проариотические промоторы ³ . Для облегчения этой проблемы были использованы несколько подходов; Включая введение тандемных повторов перед вирусными последовательностями ⁴ , мутацию предполагаемых прокариотических промоторных последовательностей ⁵ , расщепление генома на множественные плазмиды ⁶ , векторы с небольшим числом копий (включая бактериальные искусственные хромосомы) ^7,8 и введение интронов в вирусном геноме ⁹ , Для ZIKV была описана одна полноразмерная система без модификаций; Однако этот клон, по-видимому, ослабляется в клеточной культуре и у мышей ¹⁰ . Другие группы сконструировали интроны в геноме ZIKV, что позволило нарушить неустойчивые последовательности в бактериях, которые могут быть сплавлены в клетках млекопитающих in vitro для производства инфекционного вируса ^{11, 12} . Кроме того, была успешно использована система на основе ПЦР, озаглавленная «Инфекционно-субгеномные ампликонны», для спасения штампа MR776 прототипа ZIKV ¹³ . Описанный здесь подход не требует никаких посторонних последовательностей, а скорее разрушает геном в области высокой нестабильности с использованием множества плазмид, которые ранее успешно использовались с желтой лихорадкой ⁶ , вирусами лихорадки денге ^{14 , 15} и западного Нила ¹⁶ . Кроме того, добавление последовательности рибозима гепатита D на вирусных геномных концах облегчает создание аутентичного 3'-конца без необходимости добавления сайта линеаризации. Кроме того, обе плазмиды сконструированы в низкокопированном числовом векторе (pACYC177, ~ 15 копий на ячейку) для уменьшения любой остаточной токсичности ¹⁷ . Выбранный вирус отображает профиль роста, сопоставимый сРодительского вируса в кривых роста in vitro в 8 клеточных линиях, содержащих множество клеточных типов, полученных как от млекопитающих, так и от насекомых, и выявил идентичные патогенные профили у мышей и инфекции, скорости распространения и передачи у комаров ¹⁸ .

Здесь подробно описан протокол, описывающий, как выращивать инфекционные клоновые плазмиды, генерировать полноразмерную вирусную РНК (вирусный геном) in vitro и восстанавливать инфекционный вирус в культуре клеток. Во-первых, мы описываем распространение плазмид в бактериях или без бактерий амплификации с использованием усиления кругового круга (RCA). Затем мы покажем, как две плазмиды расщепляются, а затем лигируются вместе для генерации полноразмерного вируса. Наконец, мы описываем производство транскрибируемой РНК и ее последующей электропорации в клетки Vero с последующим титрованием восстановленного вируса ( рис. 1 ). Описанный подход является быстрым, что позволяетR восстановление запасов инфекционных вирусов через 1-2 недели.