新世界Zikaウイルス感染クローンからの組換えウイルスの救出とキャラクタリゼーション

Zikaウイルス（ZIKV; Family Flaviviridae ： Flavivirus属）は、2013-14年にブラジルに到着した蚊媒介性フラビウイルスであり、以後、アメリカ全土に広がった熱性疾患の大規模な発生に関連して^います¹ 。さらに、ZIKVは、成人のギラン・バレー症候群や胎児や新生児の小頭症などの重篤な疾患の結果と関連している² 。西半球で急速に普及する前はZIKVについてほとんど知られていなかった。これには分子ツールの欠如が含まれており、したがって機構的研究が妨げられている。感染性cDNAクローンなどのウイルスのための分子ツールは、ワクチンおよび抗ウイルス治療の開発を容易にし、差別的ウイルス病原性、免疫応答およびウイルスの進化に関連するウイルス遺伝因子の評価を可能にする。

フラビウイルスの感染性クローンは、crのため細菌中で非常に不安定であることが知られているそれらのゲノムに存在する恒温性原核生物プロモーター³ 。この問題を改善するためにいくつかのアプローチが用いられてきた。ゲノムを複数のプラスミド⁶に分割すること、低コピー数のベクター（細菌人工染色体を含む） ^7,8およびウイルスゲノム^9にイントロンを挿入することを含む、ウイルスゲノム^9の上流にタンデムリピートの挿入を含む。 ZIKVについては、変更のない1つの全長システムが記載されている。しかし、このクローンは細胞培養およびマウスにおいて弱毒化されているようであった¹⁰ 。他のグループは、イントロンをZIKVゲノムに組み込んで、インビトロで感染性ウイルス^11の産生のために哺乳類細胞でスプライシングされ得る細菌中の不安定な配列の破壊を可能にする^{、 12} 。さらに、感染性サブゲノム – アンプリコンと命名されたPCRベースのシステムは、ZIKV ^13の原型MR766株を救済するために首尾よく使用されている。ここに記載されているアプローチは外来配列を必要とせず、以前は黄熱病⁶ 、デング^14,15および西ナイルウイルス^16で成功裡に使用されている複数のプラスミドを使用することによって、不安定性の高い領域でゲノムを破壊する。さらに、ウイルスゲノム末端でのD型肝炎リボザイム配列の付加は、線状化部位の追加を必要とせずに本物の3 '末端の作製を容易にする。さらに、両方のプラスミドは、低コピー数ベクター（pACYC177、1細胞あたり約15コピー）で構築され、残留毒性を軽減する¹⁷ 。回収されたウイルスは、哺乳動物および昆虫の両方から誘導された様々な細胞型を含む8細胞株におけるインビトロ増殖曲線における親ウイルスであり 、マウスにおいて同一の病原性プロファイルおよび蚊における感染、播種および感染率を示した¹⁸ 。

本明細書では、感染性クローンプラスミドを増殖させ、インビトロで全長ウイルスRNA（ウイルスゲノム）を生成し 、細胞培養で感染性ウイルスを回収する方法を記載するプロトコルを詳述する。まず、バクテリアにおけるプラスミドの増殖またはローリングサークル増幅（RCA）を用いた無細菌増幅について説明する。次に、2つのプラスミドがどのように消化され、続いて完全な長さのウイルスを生成するために一緒に連結されるかを示す。最後に、転写されたRNAの産生およびその後のVero細胞への電気穿孔、続いて回収されたウイルスの滴定（ 図1 ）について説明する。説明されたアプローチは迅速であり、fo1〜2週間で感染性ウイルス株を回収する。