Le sauvetage et la caractérisation du virus recombinant à partir d'un nouveau clone infectieux du virus Zika du monde

Le virus Zika (ZIKV; Family Flaviviridae : Genre Flavivirus ) est un flavivirus transmis par des moustiques qui est arrivé au Brésil en 2013-14 et a ensuite été associé à une épidémie massive de maladie fébrile qui s'est répandue dans les Amériques ¹ . En outre, le ZIKV a été lié à des résultats sévères liés à la maladie, tels que le syndrome de Guillain-Barré chez les adultes et la microcéphalie chez les fœtus et les nouveau-nés ² . On savait peu à propos de ZIKV avant sa propagation rapide dans l'hémisphère occidental. Cela comprenait un manque d'outils moléculaires, entravant ainsi la recherche mécanique. Les outils moléculaires pour les virus, tels que les clones d'ADNc infectieux, facilitent le développement thérapeutique des vaccins et des antiviraux et permettent l'évaluation des facteurs génétiques viraux liés à la pathogenèse virale différentielle, à la réponse immunitaire et à l'évolution virale.

Les clones infectieux de Flavivirus sont connus pour être très instables dans les bactéries en raison de crLes promoteurs procaryotes yptiques présents dans leurs génomes ³ . Plusieurs approches ont été utilisées pour améliorer ce problème; Y compris l'insertion de répétitions en tandem en amont des séquences virales ⁴ , la mutation des séquences promoteurs procaryotes putatives ⁵ , le fractionnement du génome dans de multiples plasmides ⁶ , des vecteurs numériques à faible copie (y compris les chromosomes artificiels bactériens) ^{7 , 8} et l'insertion d'introns dans le génome viral ⁹ . Un système complet sans modifications a été décrit pour ZIKV; Cependant, ce clone semble être atténué dans la culture cellulaire et chez la souris ¹⁰ . D'autres groupes ont incorporé des introns dans le génome de ZIKV, permettant une perturbation de séquences instables dans des bactéries qui peuvent être épissées dans des cellules de mammifères in vitro pour la production de virus infectieux ^{11, 12} . En outre, un système basé sur la PCR intitulé Infectious-Subgenomic-Amplicons a été utilisé avec succès pour sauver le prototype de souche MR766 de ZIKV ¹³ . L'approche décrite ici ne nécessite pas de séquences étrangères, mais perturbe le génome dans la région d'une forte instabilité en utilisant de multiples plasmides, qui ont déjà été utilisés avec succès avec la fièvre jaune ⁶ , la dengue ^{14 , 15} et le virus du Nil occidental ¹⁶ . En outre, l'addition de la séquence de ribozyme de l'hépatite D au niveau de la terminaison génomique virale facilite la création d'une fin authentique 3 'sans avoir besoin d'ajouter un site de linéarisation. En outre, les deux plasmides sont construits dans un vecteur à nombre de copies faible (pACYC177, ~ 15 copies par cellule) pour atténuer toute toxicité résiduelle ¹⁷ . Le virus récupéré affiche un profil de croissance comparable àVirus parental dans les courbes de croissance in vitro dans 8 lignées cellulaires comprenant une variété de types de cellules dérivées à la fois de mammifères et d'insectes et a présenté des profils pathogènes identiques chez la souris et les taux d'infection, de diffusion et de transmission chez les moustiques ¹⁸ .

Dans ce document, nous détaillons un protocole décrivant comment développer les plasmides de clones infectieux, générer de l'ARN viral complet (le génome viral) in vitro et récupérer le virus infectieux dans la culture cellulaire. Tout d'abord, nous décrivons la propagation de plasmides dans des bactéries ou une amplification sans bactéries à l'aide de l'amplification du cercle circulant (RCA). Ensuite, nous montrons comment les deux plasmides sont digérés puis ensuite ligaturés ensemble pour générer des virus complets. Enfin, nous décrivons la production de l'ARN transcrit et son électroporation subséquente dans les cellules Vero, suivi du titrage du virus récupéré ( Figure 1 ). L'approche décrite est rapide, ce qui permetR récupération des stocks de virus infectieux en 1-2 semaines.