Redding en karakterisering van het recombinante virus van een nieuwe infectieuze kloon van de Zika Virus
Summary
Dit protocol beschrijft het herstel van infectief Zika-virus uit een infectieuze cDNA-kloon met twee plasmiden.
Abstract
Infectieuze cDNA-klonen zorgen voor genetische manipulatie van een virus, waardoor werk wordt vergemakkelijkt bij vaccins, pathogenese, replicatie, transmissie en virale evolutie. Hier beschrijven we de constructie van een besmettelijke kloon voor Zika virus (ZIKV), die momenteel een explosief uitbraak in Amerika veroorzaakt. Om toxiciteit te voorkomen voor bacteriën die gewoonlijk worden waargenomen met flavivirus-afgeleide plasmiden, gaven we een tweedimplantsysteem op dat het genoom bij het NS1-gen scheidt en stabieler is dan volledige constructies die niet succesvol zouden kunnen worden hersteld zonder mutaties. Na spijsvertering en ligatie om de twee fragmenten aan te sluiten kan full-length virale RNA gegenereerd worden door in vitro transcriptie met T7 RNA polymerase. Na elektroporatie van getranscribeerde RNA in cellen werd virus hersteld die respectievelijk dezelfde in vitro groei kinetiek en in vivo virulentie en infectie fenotypen vertoonde in respectievelijk muizen en muggen.
Introduction
Zika-virus (ZIKV; Family Flaviviridae : Genus Flavivirus ) is een muskietgedragen flavivirus die in 2013-14 in Brazilië is aangekomen en vervolgens geassocieerd werd met een massale uitbraak van febriele ziekte die zich verspreidde over heel Amerika 1 . Daarnaast is ZIKV verbonden met ernstige ziekte-uitkomsten, zoals Guillain-Barré syndroom bij volwassenen en microcefalie bij foetussen en neonaten 2 . Weinig was bekend over ZIKV voor zijn snelle verspreiding in het westelijk halfrond. Dit omvatte een gebrek aan moleculaire hulpmiddelen, waardoor mechanistisch onderzoek werd belemmerd. Moleculaire hulpmiddelen voor virussen, zoals infectieuze cDNA-klonen, vergemakkelijken vaccin- en antivirale therapeutische ontwikkeling, en staan voor de beoordeling van virale genetische factoren die verband houden met differentiële virale pathogenese, immuunrespons en virale evolutie.
Flavivirus-infectieuze klonen zijn bekend als zeer instabiele bacteriën door crYptische prokaryotische promotors aanwezig in hun genen 3 . Verschillende benaderingen zijn gebruikt om dit probleem te verbeteren; Inclusief het inbrengen van tandemherhalen stroomopwaarts van virale sequenties 4 , mutatie van vermoedelijke prokaryotische promotorsekvensen 5 , het splitsen van het genoom in meerdere plasmiden 6 , vectoren met lage kopieën (inclusief bacteriële kunstmatige chromosomen) 7 , 8 en het inbrengen van intromen in het virale genoom 9 . Een volledige lengte systeem zonder wijzigingen is beschreven voor ZIKV; Deze kloon bleek echter te worden verzwakt in celkweek en in muizen 10 . Andere groepen hebben introns in het ZIKV genoom ingezet, waardoor verstoringen van onstabiele sequenties in bacteriën kunnen worden uitgesplitst die in vitro kunnen worden uitgesplitst in zoogdiercellen voor het produceren van infectieus virus 11, 12 . Bovendien is een PCR-based systeem getiteld Infectious-Subgenomic-Amplicons succesvol gebruikt om de prototype MR766-stam van ZIKV 13 te redden. De hier beschreven werkwijze vereist geen vreemde sequenties, maar versteur het genoom in het gebied van hoge instabiliteit door gebruik te maken van meerdere plasmiden, die eerder succesvol is gebruikt met gele koorts 6 , dengue 14 , 15 en West-Nile virussen 16 . Bovendien vergemakkelijkt de toevoeging van de hepatitis D-ribozymsequentie bij de virale genomische termini de creatie van een authentiek 3'-einde zonder de noodzaak van de toevoeging van een linearisatieplaats. Bovendien worden beide plasmiden geconstrueerd in een vector met lage kopieën (pACYC177, ~ 15 kopieën per cel) om eventuele resterende toxiciteit 17 te verzachten. Het herstelde virus toont een groeiprofiel dat vergelijkbaar is metOuderlijk virus in in vitro groeikrommen in 8 cellijnen die een verscheidenheid van celletypes afkomstig zijn van zowel zoogdieren als insecten, en heeft identieke pathogene profielen in muizen en infectie-, verspreiding- en overdrachtssnelheden in muggen 18 tentoongesteld.
Hierin beschrijven we een protocol dat beschrijft hoe de infectieuze kloonplasmiden worden ontwikkeld, in vitro volledige virale RNA (het virale genoom) genereren en infectieus virus in celcultuur herstellen. Ten eerste beschrijven we de voortplanting van plasmiden in bacteriën of bacteriënvrije amplificatie met behulp van rollende cirkel amplificatie (RCA). Vervolgens laten we zien hoe de twee plasmiden worden verteerd en daarna gelijktijdig geligeerd worden om full-length virus te genereren. Tenslotte beschrijven we de productie van getranscribeerde RNA en de daaropvolgende elektroporatie in Vero-cellen, gevolgd door titratie van hersteld virus ( Figuur 1 ). De beschreven benadering is snel, waardoor foHet herstel van besmettelijke virusvoorraad in 1-2 weken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic en Claudia Rückert bedanken voor hun hulp bij het karakteriseren van het kloon afgeleide virus. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van het Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten, NIH onder subsidies AI114675 (BJG) en AI067380 (GDE).
Materials
| NEB Stable CompetentE. coli | New England BioLabs | C3040H | |
| Carbenicillin, Disodium Salt | various | ||
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4036 | |
| ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit | Zymo Research | D4202 | |
| SalI-HF | New England BioLabs | R3138S | 20,000 units/ml |
| NheI-HF | New England BioLabs | R3131S | 20,000 units/ml |
| ApaLI | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/ml |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | 20,000 units/ml |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | 20,000 units/ml |
| HindIII-HF | New England BioLabs | R3104S | 20,000 units/ml |
| illustra TempliPhi 100 Amplification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25640010 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 units/ml |
| Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England BioLabs | M0290S | 10,000 units/ml |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | 400,000units/mL |
| HiScribe T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs | E2065S | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| ECM 630 High Throughput Electroporation System | BTX | 45-0423 | Other machines are acceptable. |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma | L3147 | Can be homemade as well. |
| Terrific Broth | Sigma | T0918 | Can be homemade as well. |
| Petri Dish | Celltreat | 229693 | |
| Culture Tubes | VWR International | 60818-576 | |
| T75 flasks | Celltreat | 229340 | |
| T182 flasks | Celltreat | 229350 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| Tragacanth Powder | MP Bio | MP 104792 | |
| Crystal Violet | Amresco | 0528-1006 | |
| Ethanol Denatured | VWR International | BDH1156-1LP | |
| 6 well plate | Celltreat | 229106 | |
| 12 well plate | Celltreat | 229111 | |
| Sequencing Oligos | IDT | see table 1 | |
| Qubit 3.0 | ThermoFisher | Qubit 3.0 | other methods are acceptable. |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher | Q32850 | other methods are acceptable. |
| Qubit RNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32852 | other methods are acceptable. |
| Class II Biosafety Cabinet | Varies | N/A | This is necessary for live-virus work. |
References
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675C-686C (2016).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome–case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveill. 19 (9), (2014).
- Li, D., Aaskov, J., Lott, W. B. Identification of a cryptic prokaryotic promoter within the cDNA encoding the 5′ end of dengue virus RNA genome. PLoS One. 6 (3), e18197 (2011).
- Pu, S. Y., et al. A novel approach to propagate flavivirus infectious cDNA clones in bacteria by introducing tandem repeat sequences upstream of virus genome. J Gen Virol. 95 (Pt 7), 1493-1503 (2014).
- Pu, S. Y., et al. Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes. J Virol. 85 (6), 2927-2941 (2011).
- Rice, C. M., Grakoui, A., Galler, R., Chambers, T. J. Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation. New Biol. 1 (3), 285-296 (1989).
- Yun, S. I., Kim, S. Y., Rice, C. M., Lee, Y. M. Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus. J Virol. 77 (11), 6450-6465 (2003).
- Gualano, R. C., Pryor, M. J., Cauchi, M. R., Wright, P. J., Davidson, A. D. Identification of a major determinant of mouse neurovirulence of dengue virus type 2 using stably cloned genomic-length cDNA. J Gen Virol. 79 (Pt 3), 437-446 (1998).
- Johansen, I. E. Intron insertion facilitates amplification of cloned virus cDNA in Escherichia coli while biological activity is reestablished after transcription in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (22), 12400-12405 (1996).
- Shan, C., et al. An Infectious cDNA Clone of Zika Virus to Study Viral Virulence, Mosquito Transmission, and Antiviral Inhibitors. Cell Host Microbe. 19 (6), 891-900 (2016).
- Schwarz, M. C., et al. Rescue of the 1947 Zika Virus Prototype Strain with a Cytomegalovirus Promoter-Driven cDNA Clone. mSphere. 1 (5), (2016).
- Tsetsarkin, K. A., et al. A Full-Length Infectious cDNA Clone of Zika Virus from the 2015 Epidemic in Brazil as a Genetic Platform for Studies of Virus-Host Interactions and Vaccine Development. MBio. 7 (4), (2016).
- Gadea, G., et al. A robust method for the rapid generation of recombinant Zika virus expressing the GFP reporter gene. Virology. 497, 157-162 (2016).
- Kapoor, M., Zhang, L., Mohan, P. M., Padmanabhan, R. Synthesis and characterization of an infectious dengue virus type-2 RNA genome (New Guinea C strain). Gene. 162 (2), 175-180 (1995).
- Messer, W. B., et al. Development and characterization of a reverse genetic system for studying dengue virus serotype 3 strain variation and neutralization. PLoS Negl Trop Dis. 6 (2), e1486 (2012).
- Kinney, R. M., et al. Avian virulence and thermostable replication of the North American strain of West Nile virus. J Gen Virol. 87 (Pt 12), 3611-3622 (2006).
- Chang, A. C., Cohen, S. N. Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid. J Bacteriol. 134 (3), 1141-1156 (1978).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone. J Virol. 91 (1), (2017).
- Roberts, P. L., Lloyd, D. Virus inactivation by protein denaturants used in affinity chromatography. Biologicals. 35 (4), 343-347 (2007).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. (93), e52065 (2014).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone. J Virol. , (2016).
- Grubaugh, N. D., et al. Genetic Drift during Systemic Arbovirus Infection of Mosquito Vectors Leads to Decreased Relative Fitness during Host Switching. Cell Host Microbe. 19 (4), 481-492 (2016).
