Un método rápido y eficiente para disecar alas Pupal de Drosophila apto para Immunodetections o ensayos PCR
Summary
La capacidad para detectar con precisión las transcripciones o las proteínas en los tejidos de la Drosophila es fundamental para el estudio de su abundancia y localización relacionada con el proceso de desarrollo. Aquí está la descripción de un sencillo procedimiento para disecar alas pupas. Estas alas pueden utilizarse como muestras en diversas técnicas (análisis de PCR, immunohistochemistry, etc.).
Abstract
Desarrollo del ala de Drosophila melanogaster es un modelo ideal para el estudio de morfogénesis a nivel de tejido. Estos Apéndices se convierten de un grupo de células llamado discos imaginal de ala formados durante el desarrollo embrionario. En las etapas larvales los discos imaginales crecen, aumentando su número de células y la formación de estructuras epiteliales monolayered. Dentro de la envoltura pupal, los discos imaginales bud hacia fuera y doblan en bicapas a lo largo de una línea que se convierte en el futuro margen de la ala. Durante este proceso, las venas longitudinales primodia originan células de vena sobre las posibles superficies dorsales y ventrales del ala. Durante la etapa de pupa las rayas de las células de la vena de cada superficie de comunican para generar tubos apretados; al mismo tiempo, las venas Cruz comienzan su formación.
Con la ayuda de marcadores moleculares adecuados, es posible identificar los elementos principales que componen el ala durante su desarrollo. Por esta razón, la capacidad para detectar con precisión las transcripciones o las proteínas en esta estructura es fundamental para el estudio de su abundancia y localización relacionada con el proceso de desarrollo del ala.
El procedimiento descrito aquí se centra en manipular alas pupas, proporcionando instrucciones detalladas sobre cómo diseccionar el ala durante la etapa pupal. La disección de tejidos pupal es más difícil de realizar que sus contrapartes en larvas de tercer estadio. Por esta razón este enfoque fue desarrollado, para obtener muestras de alta calidad rápida y eficiente. Detalles de cómo immunostain y Monte estas muestras de ala, para permitir la visualización de proteínas o componentes de la célula, se encuentran en el protocolo. Con experiencia es posible recoger alas pupal de 8-10 alta calidad en un corto período de tiempo.
Introduction
Las alas de Drosophila se desarrollan desde los discos imaginal de ala. Primordial de estos discos de ala se ponen a un lado durante el desarrollo embrionario como pequeños grupos de 20-30 células imaginales que invaginate del epitelio embrionario. Mientras que la larva crece en la tercera etapa del estadio, mitosis se produce en las células imaginales en momentos característicos específicos elevando su número (aproximadamente 50000 células) y formando el ala disco1,2,3, 4. Como las células proliferan, forme un epitelio tubular, resultando en un espiral compacto auto plegable. Durante la pupación, el epitelio del disco telescopios a ala forma dos capas y las venas longitudinales comienzan como lagunas entre ellas, que ocurre dos veces durante ala del desarrollo5,6.
El arreglo de venas siempre tiene un patrón idéntico; la habilidad de identificar fácilmente cada alteración en la formación de las venas hace mutaciones muy visibles (por ejemplo, falta o extra venas, cambios en las posiciones de vena, etcetera.). Curiosamente, las variaciones de fenotipo son generalmente la evidencia de mutaciones en los componentes conocidos o nuevos de vías que son relevantes para el desarrollo del ala de señalización. Uno de los caminos que juega un papel en determinar la posición y mantener la vena y territorios intervein es la vía de Hedgehog (Hh)6,7,8.
Dada la importancia del ala pupa como un modelo de sistema, será importante obtener muestras de buena calidad para trabajar con. En el pasado, los científicos que han publicado protocolos para diseccionar las alas de Drosophila no han dado una guía apropiada para lograr muestras viables. Sin la dirección de un investigador uno no puede visualizar claramente el proceso. En estos enfoques alternativos de disección la pupa es dividida en dos, separando el ala del tejido circundante y lavada varias veces para eliminar los desechos. Este tipo de enfoque pretende dejar la puerta libre de contaminantes, pero debido a la experiencia previa en el proceso es más lento y existe una mayor probabilidad de comprometer la estructura de las frágiles alas9.
El procedimiento descrito aquí fue desarrollado por la demanda para encontrar un método rápido y eficiente para obtener muestras de ala pupa adecuadas detectar proteínas específicas o las transcripciones mediante inmunodetección de protocolos o ensayos de reacción en cadena (PCR) polimerasa. Para ilustrar esto, la expresión y localización de Patched (Ptc o receptor de la canónico de la vía de Hh) se detecta en muestras ala pupa, proporcionando un protocolo que incluye detalles relevantes con éxito para llevar a cabo la completa procedimiento.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método de disección se describe en este vídeo puede utilizarse para preparar muestras de alta calidad de alas pupas de Drosophila de diversas etapas del desarrollo de muchos tipos de técnicas (por ejemplo, la inmunofluorescencia, la síntesis de cDNA para análisis PCR, in vitro desarrollo del ala). En este método el científico involucrados han utilizado 24-30 h APF. Sin embargo debe haber ningún obstáculo dentro de los pasos esenciales en la disección de pupa más joven o más vie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a CSIC por el apoyo financiero dado este proyecto, Mariana Di Doménico para su asistencia técnica con microscopia confocal; a José Leonardo Báez para sus correcciones del manuscrito; a Luciano Correa por su dedicación a la creación del vídeo; a Natalia Rosano por prestar su voz para el vídeo y el Bloomington Drosophila Stock Center para proporcionar los recursos utilizados en este estudio. El Apa1 monoclonal anti-Ptc desarrollado por Isabel Guerrero fue obtenido de banco de hibridoma estudios del desarrollo (DSHB) bajo los auspicios de la NICHD y mantenido por departamento de ciencias biológicas, la Universidad de Iowa, Iowa City, IA 52242.
Materials
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ1000 | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Microscope slides | StarFrost | 8037/1 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Scissors | Lawton | 63-1400 | |
| Multi-well plastic dish | Thermo Scientific | 144444 | |
| p100 or p200 pipette | Finnpipette (Labsystems) | 9400130 | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| TRIzol Reagent | Ambion | 15596026 | |
| DEPC treated water | MO.BIO | 17011-200 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL (working dilution 1/800) |
Invitrogen | A11030 | |
| Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μg/mL (working dilution 1/100) |
Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. | |
| DAPI, 1 mg/mL (working dilution 1/5000) |
Invitrogen | 62248 | |
| Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol (1/600 working dilution) |
Invitrogen | A12379 | |
| Canton S (fly stock) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
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