Un metodo rapido ed efficiente per sezionare Pupal ali della drosofila adatto per Immunodetections o analisi di PCR
Summary
La capacità di rilevare con precisione le trascrizioni o proteine nei tessuti della drosofila è fondamentale per lo studio della loro abbondanza e localizzazione relazionati al processo di sviluppo. Ecco la descrizione di una procedura semplice per dissecare pupale ali. Queste ali possono essere utilizzate come campioni in diverse tecniche (immunohistochemistry, analisi di PCR, ecc.).
Abstract
Lo sviluppo dell’ala in Drosophila melanogaster è un modello ideale per studiare la morfogenesi a livello del tessuto. Queste appendici si sviluppano da un gruppo di cellule che si chiamano dischi immaginali ala formate durante lo sviluppo embrionale. In stadi larvali si sviluppano i dischi immaginali, aumentando il numero delle cellule e formando strutture epiteliali monostrati. All’interno del caso pupal, i dischi immaginali bud fuori e piegare in doppii strati lungo una linea che diventa il futuro margine dell’ala. Durante questo processo, le vene longitudinali primodia provengono vena cellule sulle superfici dorsali e ventrali prospettica dell’ala. Durante la fase di pupa le strisce delle cellule della vena di ogni superficie comunicano al fine di generare tubi stretti; allo stesso tempo, la croce-vene iniziano la loro formazione.
Con l’aiuto di marcatori molecolari appropriati, è possibile identificare gli elementi principali che compongono l’ala durante il suo sviluppo. Per questo motivo, la capacità di rilevare con precisione le trascrizioni o proteine in questa struttura è fondamentale per lo studio della loro abbondanza e localizzazione relazionati al processo di sviluppo dell’ala.
La procedura qui descritta si concentra sulla manipolazione pupale Ali, fornendo istruzioni dettagliate su come sezionare l’ala durante la fase di pupa. La dissezione del tessuto pupal è più difficile da eseguire rispetto alle loro controparti in terzo instar larve. Ecco perché questo approccio è stato sviluppato, per ottenere campioni di alta qualità rapido ed efficiente. Dettagli di come immunostain e Monte questi esempi di ala, per consentire la visualizzazione delle proteine o dei componenti delle cellule, vengono forniti nel protocollo. Con poca esperienza è possibile raccogliere Ali pupal di alta qualità di 8-10 in un breve lasso di tempo.
Introduction
Ali di Drosophila sono sviluppate dai dischi immaginali ala. La primordiale di questi dischi ala vengono messe da parte durante lo sviluppo embrionale come piccoli gruppi di 20-30 cellule immaginale che invaginano dall’epitelio embrionale. Mentre la larva cresce alla terza fase instar, mitosi si verifica nelle cellule immaginale in specifici momenti caratteristici alzando i suoi numeri (circa 50000 cellule) e formando l’ala disco1,2,3, 4. Come le cellule proliferano, essi moda un epitelio tubulare, risultante in una spirale auto-pieghevole compatta. Durante impupamento, l’epitelio disco telescopi fuori all’ala forma i due strati e le vene longitudinali iniziare come lacune tra di loro, che si verifica due volte durante ala dello sviluppo5,6.
La disposizione delle vene sempre ha un modello identico; la capacità di identificare facilmente ogni alterazione all’interno della formazione di vene rende mutazioni estremamente visibile (ad esempio mancanti o aggiuntivi vene, cambiamenti in vena posizioni, ecc.). Interessante, le variazioni di fenotipo sono solitamente le prove delle mutazioni nei componenti noti o romanzo di vie che sono rilevanti per lo sviluppo dell’ala di segnalazione. Una delle vie che svolge un ruolo nella determinazione della posizione e della manutenzione della vena e intervein territori è il pathway di Hedgehog (Hh)6,7,8.
Data l’importanza dell’ala pupal come sistema modello, sarà importante ottenere campioni di buona qualità per lavorare con. In passato, gli scienziati che hanno pubblicato i protocolli per sezionare Drosophila Ali non hanno dato una guida appropriata per raggiungere campioni realizzabili. Senza la Guida di un ricercatore, uno non può visualizzare chiaramente il processo. In questi approcci alternativi per dissezione la pupa è divisa in due, separando l’ala dal tessuto circostante e ripetutamente lavata per rimuovere i detriti. Questo tipo di approccio sostiene di lasciare l’ala libera di contamina, ma a causa di precedenti esperienze il processo è più lento e c’è una maggiore probabilità di compromettere la struttura delle ali fragili9.
La procedura qui descritta è stata sviluppata dall’esigenza di trovare un metodo veloce ed efficiente per ottenere campioni di pupal ala adatti per rilevare specifiche proteine o trascrizioni utilizzando protocolli immunodetection o analisi di reazione a catena (PCR) della polimerasi. Per illustrare questo, l’espressione e la localizzazione di Patched (Ptc o il recettore canonico del pathway di Hh) viene rilevato in campioni di pupal ala, fornendo un protocollo che include dettagli rilevanti per svolgere con successo la completa procedura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo della dissezione descritto in questo video può essere utilizzato per preparare campioni di alta qualità di Drosophila pupale ali dalle fasi differenti di sviluppo per molti tipi di tecniche (ad es., immunofluorescenza, sintesi di cDNA per analisi di PCR, in vitro sviluppo di ala). In termini di questo metodo lo scienziato coinvolto hanno usato 24-30 h APF. Tuttavia, non ci dovrebbe essere nessun ostacolo entro i passi essenziali nella dissezione di pupa più giovane o più anziani….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare CSIC per il sostegno finanziario dato a questo progetto, a Mariana Di Doménico per la sua assistenza tecnica con microscopia confocale; per José Leonardo Báez per correzioni suo manoscritto; a Luciano Correa per la sua dedizione alla creazione di video; a Natalia Rosano per prestando la sua voce per il video e Bloomington Drosophila Stock Center per fornire le scorte utilizzate in questo studio. La PA1 monoclonale anti-Ptc sviluppato da Isabel Guerrero è stato ottenuto da inerente allo sviluppo studi Hybridoma Bank (DSHB) sotto l’egida del NICHD e gestito dal dipartimento di scienze biologiche, The University of Iowa, Iowa City, IA 52242.
Materials
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ1000 | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Microscope slides | StarFrost | 8037/1 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Scissors | Lawton | 63-1400 | |
| Multi-well plastic dish | Thermo Scientific | 144444 | |
| p100 or p200 pipette | Finnpipette (Labsystems) | 9400130 | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| TRIzol Reagent | Ambion | 15596026 | |
| DEPC treated water | MO.BIO | 17011-200 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL (working dilution 1/800) |
Invitrogen | A11030 | |
| Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μg/mL (working dilution 1/100) |
Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. | |
| DAPI, 1 mg/mL (working dilution 1/5000) |
Invitrogen | 62248 | |
| Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol (1/600 working dilution) |
Invitrogen | A12379 | |
| Canton S (fly stock) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
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