طريقة سريعة وفعالة لتشريح أجنحة المورفولوجية مناسبة إيمونوديتيكشنز أو فحوصات بكر الخوادر
Summary
القدرة على الكشف عن دقة النصوص أو البروتينات في الأنسجة المورفولوجية أمر بالغ الأهمية لدراسة ما وفرة والتعريب المتصلة بعملية التنمية. هنا هو وصف لإجراءات واضحة تشريح أجنحة الخوادر. يمكن استخدام هذه الأجنحة كعينات في العديد من التقنيات (إيمونوهيستوتشيميستري، وفحص PCR، إلخ).
Abstract
وضع الجناح في melanogaster المورفولوجية نموذجا مثاليا لدراسة morphogenesis على مستوى الأنسجة. تطوير هذه الملاحق من مجموعة من الخلايا المسماة الجناح أقراص imaginal شكلت أثناء التطور الجنيني. في مراحل اليرقات تنمو أقراص إيماجينال، زيادة في عدد الخلايا وتشكيل هياكل طلائي مونولاييريد. داخل القضية الخوادر، برعم بأقراص إيماجينال وإضعاف في بيلاييرس على طول خط يصبح الهامش مستقبلا من الجناح. أثناء هذه العملية، تنشأ العروق الطولية بريموديا الخلايا المنطلق على السطوح الظهرية والبطني المحتملين من الجناح. خلال مرحلة الخوادر المشارب الخلايا الوريد لكل سطح الاتصال من أجل إنشاء أنابيب ضيقة؛ في الوقت نفسه، تبدأ عبر الأوردة تكونها.
بمساعدة الواسمات الجزيئية الملائمة، من الممكن تحديد العناصر الرئيسية يؤلف الجناح أثناء تطورها. ولهذا السبب، القدرة على دقة الكشف عن وقائع أو البروتينات في هذا الهيكل حاسم بالنسبة للذين يدرسون وفرة والتعريب المتصلة بعملية التنمية للجناح.
ووصف الإجراء هنا يركز على التلاعب بأجنحة الخوادر، توفير إرشادات مفصلة حول كيفية تشريح الجناح خلال مرحلة الخوادر. تشريح الأنسجة الخوادر أكثر صعوبة لأداء نظرائهن في يرقات الطور الثالث. وهذا السبب في وضع هذا النهج، للحصول على عينات سريع وكفاءة عالية الجودة. وترد تفاصيل عن كيفية إيمونوستين وجبل هذه العينات الجناح، للسماح للتصور من البروتينات أو مكونات الخلية، في البروتوكول. مع القليل من الخبرة من الممكن جمع 8-10 أجنحة الخوادر ذات جودة عالية في فترة قصيرة من الزمن.
Introduction
يتم تطوير أجنحة المورفولوجية من أقراص إيماجينال الجناح. البدائي لهذه الأقراص الجناح جانبا أثناء التطور الجنيني كمجموعات صغيرة من الخلايا إيماجينال 20-30 التي إينفاجيناتي من ظهارة الجنينية. بينما تنمو اليرقة إلى مرحلة الطور الثالث، يحدث الانقسام في الخلايا إيماجينال في أوقات محددة مميزة رفع عدد أعضائها (حوالي 50000 الخلايا) وتشكيل الجناح القرص1،2،3، 4. كما تتكاثر الخلايا، أنها أزياء من ظهارة أنبوبي، أدى إلى تصاعد ضغط ذاتية قابلة لطي. أثناء بوباتيون، ظهارة القرص التلسكوبات خارجاً للجناح شكل الطبقات اثنين وعروق طولية تبدأ كثغرات بينهما، الذي يحدث مرتين خلال الجناح الإنمائية5،6.
وقد ترتيب الأوردة دائماً نمط مماثل؛ القدرة على التعرف بسهولة على كل تغيير في تشكيل الأوردة يجعل الطفرات مرئية جداً (مثلاً مفقودة أو إضافية الأوردة، تغييرات في مواقف الوريد، إلخ.). من المثير للاهتمام، اختلافات النمط الظاهري هي عادة أدلة الطفرات في المكونات المعروفة أو الرواية من إشارات المسارات ذات الصلة لتطوير الجناح. واحد من المسارات التي تلعب دوراً في تحديد الموقف والحفاظ على السياق والأراضي إينتيرفين هو القنفذ (ح ح) المسار6،،من78.
ونظرا لأهمية الجناح الخوادر كنظام نموذجي، سيكون من المهم الحصول على عينات ذات نوعية جيدة للعمل مع. في الماضي، لم تول العلماء التي نشرت البروتوكولات تشريح أجنحة المورفولوجية دليلاً مناسباً لتحقيق نماذج قابلة للتطبيق. دون التوجيه من باحث واحد لا يمكن تصور وضوح العملية. في هذه النهج البديل تشريح تقسيم اثنين، الفصل بين الجناح من الأنسجة المحيطة عذراء وغسلها مرارا وتكرارا لإزالة الأنقاض. يلوث هذا النوع من النهج المطالبات بمغادرة الجناح مجاناً للكن العملية أبطأ بسبب التجربة السابقة وهناك فرصة أكبر للمساس بهيكل أجنحة هشة9.
وقد وضعته الإجراء الموضح هنا الطلب لإيجاد وسيلة سريعة وفعالة للحصول على عينات الجناح الخوادر مناسبة للكشف عن بروتينات محددة أو النصوص باستخدام بروتوكولات إيمونوديتيكتيون أو فحوصات بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (PCR). ولتوضيح ذلك، التعبير والترجمة من مرقع (المؤسسة العامة للاتصالات أو مستقبلات المتعارف عليه المسار سمو) تكتشف في عينات الجناح الخوادر، توفير بروتوكول يتضمن التفاصيل ذات الصلة القيام بنجاح الكامل الإجراء.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن استخدام طريقة التشريح الموصوفة في هذا الفيديو لتحضير عينات ذات جودة عالية من أجنحة المورفولوجية الخوادر من مراحل التنمية المختلفة لأنواع كثيرة من التقنيات (مثلاً، الفلورة، كدنا توليف لفحوصات بكر، في المختبر الجناح التنمية). فيما يتعلق بهذه الطريقة قد استخدمت العلماء…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر السفن للدعم المالي المقدم لهذا المشروع، ماريانا Di Doménico لها المساعدة التقنية مع الفحص المجهري [كنفوكل]؛ لخوسيه ليوناردو باييز التصويبات مخطوطة له؛ لكوريا لوتشيانو لتفانيه في خدمة إنشاء الفيديو؛ إلى ناتاليا Rosano للإقراض صوتها للفيديو و المورفولوجية بلومينغتون مركز الأوراق المالية توفير الأرصدة المستخدمة في هذه الدراسة. حصل من الضفة هيبريدوما الدراسات الإنمائية (دشب) تحت إشراف NICHD Apa1 [مونوكلونل] مكافحة–المؤسسة العامة للاتصالات المتقدمة من إيزابيل غيريرو ويحتفظ بها جامعة آيوا، قسم العلوم البيولوجية، 52242 مدينة آيوا، ألف.
Materials
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ1000 | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Microscope slides | StarFrost | 8037/1 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Scissors | Lawton | 63-1400 | |
| Multi-well plastic dish | Thermo Scientific | 144444 | |
| p100 or p200 pipette | Finnpipette (Labsystems) | 9400130 | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| TRIzol Reagent | Ambion | 15596026 | |
| DEPC treated water | MO.BIO | 17011-200 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL (working dilution 1/800) |
Invitrogen | A11030 | |
| Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μg/mL (working dilution 1/100) |
Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. | |
| DAPI, 1 mg/mL (working dilution 1/5000) |
Invitrogen | 62248 | |
| Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol (1/600 working dilution) |
Invitrogen | A12379 | |
| Canton S (fly stock) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
- Serrano, N., O’Farrell, P. H. Limb morphogenesis: connections between patterning and growth. Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).
- Blair, S. S. Compartments and appendage development in Drosophila. Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).
- Klein, T. Wing disc development in the fly: the early stages. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).
- Beira, J. V., Paro, R. The legacy of Drosophila imaginal discs. Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).
- De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. Developmental basis for vein pattern variations in insect wings. Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).
- Blair, S. S. Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).
- Bier, E. Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development. Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).
- De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).
- Bolatto, C., et al. Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo. Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).
- Zuniga, A., et al. Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis. BMC Biol. 7, 61 (2009).
