Discriminatie en karakterisering van heterocellulaire populaties met behulp van kwantitatieve beeldvormingstechnieken
Summary
We hebben een nieuw protocol ontwikkeld voor het bestuderen van heterocellulaire populatie dynamiek in reactie op verstoringen. Dit manuscript beschrijft een beeldvormend platform dat kwantitatieve datasets produceert voor gelijktijdige karakterisering van meerdere cellulaire fenotypen van heterocellulaire populaties op een robuuste manier.
Abstract
Cellulaire processen zijn complex en voortvloeien uit het interactie tussen meerdere celtypes en hun omgeving. Bestaande celbiologie technieken staan vaak niet toe voor een nauwkeurige interpretatie van dit interactie. Met behulp van een kwantitatieve beeldvormende aanpak presenteren wij een protocol met een hoog gehalte voor het karakteriseren van de dynamische fenotypische responsen ( dwz morfologische veranderingen, proliferatie, apoptose) van heterogene celpopulaties voor veranderingen in milieu-stimuli. We benadrukken ons vermogen om onderscheid te maken tussen celtypes, gebaseerd op fluorescentieintensiteit of inherente morfologische eigenschappen, afhankelijk van de toepassing. Dit platform zorgt voor een meer uitgebreide karakterisering van subpopulatie respons op verstoring, terwijl kortere tijd, kleinere hoeveelheden reagentia, en lagere kans op fout dan traditionele celbiologie analyses gebruikt worden. In sommige gevallen kan celpopulaties echter moeilijk zijn te identificeren en te kwantificeren op basis van complexe celluLar functies en vereist extra probleemoplossing; We onderstrepen enkele van deze omstandigheden in het protocol. We tonen deze applicatie aan met behulp van reactie op drugs in een kankermodel; Het kan echter makkelijker toegepast worden op andere fysiologische processen. Dit protocol maakt het mogelijk om subpopulaties binnen een co-cultuur systeem te identificeren en de specifieke respons van elk naar externe stimuli te karakteriseren.
Introduction
Cell-based tests zijn een werkhorse in basisonderzoek en drug ontwikkeling instellingen. De beperkingen van deze standaardbepalingen zijn echter steeds meer zichtbaar met de discordantie tussen in vitro en klinische data en het mislukken van de meeste geneesmiddelen om FDA-goedkeuring te ontvangen. Hier presenteren we een nieuwe methode voor het gebruik van kwantitatieve beeldvorming om tegelijkertijd heterocellulaire fenotypes te analyseren in reactie op relevante, samen voorkomende milieu-stimuli.
Traditionele cellen gebaseerde assays die worden gebruikt om de levensvatbaarheid van cellen te meten omvatten: trypan blue exclusion assays, MTT / MTS en Annexin V-FITC flow cytometry staining. Trypan Blue Exclusion Assays, die eenvoudig en goedkoop zijn, hebben een groot aantal cellen nodig, zijn tijdrovend en worden vaak beïnvloed door gebruikers vooroordeel 1 . MTT- en MTS-analyses bepalen indirect de levensvatbaarheid van cellen door metingen van mitochondriale metabolische snelheid. Echter, de metabolische activiTijden van cellen kunnen beïnvloed worden door verschillende kweekomstandigheden (zoals media of zuurstofconcentratie), wat leidt tot onnauwkeurige resultaten en voorkomt normalisatie over celtypen en condities 2 , 3 . Een ander belangrijk nadeel van deze technieken is hun onvermogen om onderscheid te maken tussen meerdere celtypes – de meeste biologische systemen zijn heterocellulair. Hoewel stromingscytometriemethoden het vermogen hebben om te onderscheiden tussen meerdere celpopulaties, zijn er celletiketten vereist, dynamische bemonstering is uitdagend en bij toepassing van hechtende cellen wordt deze applicatie tijdrovend en fout gevoelig.
Andere belangrijke cellulaire fenotypes, waaronder morfologische veranderingen, optreden in reactie op milieu-stimuli, maar worden niet opgevangen door traditionele cel-gebaseerde assays. Profiele celstaten door middel van morfologische karakterisering en mapping overeenkomsten over monsters is een krachtig, onbevooroordeeld instrument met de aMogelijkheid om nieuwe inzichten te geven in veel aspecten van basis- en translatieonderzoek, met inbegrip van basiscelbiologie en drugsontdekking 4 . Bovendien is aangetoond dat tumorcelmorfologie verband houdt met tumor subtypes 5 en agressiviteit 6 . Daarom is het van groot belang om deze mobiele functies te bestuderen en hoe ze betrekking hebben op specifieke milieuverstoringen. Daarnaast kan men verschillen in morfologische kenmerken gebruiken om te onderscheiden tussen subpopulaties in co-cultuur systemen. Fluorescent labeling cellen hebben downfalls ( dwz het veranderen van inherente cel eigenschappen, tijdrovend) en daarom zijn extra methoden om celtypen te classificeren voordelig.
Microscopie gebaseerde beeldvorming is een alternatieve methode voor het profileren van cellulaire fenotypes op een multiplexed, kwantitatieve en robuuste manier. In dit manuscript passen we onze kwantitatieve beeldvormingspijpleiding toe om de evolutio te markerenNijndynamiek van heterogene celpopulaties binnen een tumor. We richten ons op de interactie tussen cellen met niet-kleine celkanker (NSCLC) en kanker-geassocieerde fibroblasten (CAF's), het meest voorkomende stromale celtype dat in tumoren voorkomt. CAF's zijn betrokken bij tumorinitiatie, progressie en therapeutische respons; Daarom kan het uitvoeren van fenotypische analyses op tumorcellen bij afwezigheid van CAF's misleidende 7 , 8 , 9 zijn . Specifiek hebben we de effecten van CAF's op tumorcellen geëvalueerd in reactie op erlotinib, een klein molecuul dat de Epidermale Groeifactor Receptor (EGFR) richt, die vaak wordt gebruikt bij de klinische behandeling van NSCLC. We hebben gebruik gemaakt van een hoogwaardig screeningsplatform en de bijbehorende beeldanalysesoftware voor evaluatie; Echter, in een poging om deze methodologie toegankelijk te maken voor andere onderzoekers, hebben we ook een vergelijkbaar downstream protocol ontwikkeld met behulp van de open source software:CellProfiler 10 en CellProfiler Analyst 11 . De meeste beeld gebaseerde high-content screening analyses worden geanalyseerd met gecommercialiseerde software specifiek voor een bepaald instrument model. Resultaten zijn moeilijk te repliceren in andere laboratoria met verschillende software omdat de onderliggende algoritmen vaak eigendom zijn. Met behulp van deze beeldgebaseerde pijplijn werden cel proliferatie, dood en morfologie van elke subpopulatie van een heterocellulaire cultuur als reactie op medicijnbehandeling met behulp van zowel fluorescentie- als morfologie gebaseerde classificatie gemeten. Het volgende protocol biedt een robuuste methodologie voor het onderzoeken van complexe cellulaire processen.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol described above improves upon current cell biology assays by providing more comprehensive insights into phenotypic dynamics of multiple cell types in response to environmental perturbations while using reduced reagents and time. A major advantage of this experimental design is the ability to analyze multiple phenotypes with a single setup and generate quantitative data characterizing these phenotypes on a single cell level. One technical advantage to this platform is the ease of initial troubleshooting compared to other assays. Because this method is image-based, one is able to visualize the wells for apparent over/under seeding. It is advisable to have cells in the exponential growth phase for the duration of the experiment and not be limited by nutrient or spatial constraints or confounded by senescence due to scarce seeding. Otherwise, birth and death rates may not be reproducible between experiments. For reference, CellPD is a publicly available program for computation of birth and death rates14. Additionally, one can visualize whether adequate concentrations of dyes were added to each well. Pipetting issues in an individual well could result in missegmentation and skewed data, but can easily be detected with the aforementioned protocol.
Unfortunately, not all cell types may be amenable to this application. It is important to be able to accurately segment the nuclei and cells, therefore analysis of cells that organize in more sphere-like or clumped structures may not be suitable. For some cells, it also may be advantageous to use a cell strainer prior to seeding to ensure initial seeding of single cells. In addition, the linear classifier technique is only applicable to cell types that can be readily distinguished based on morphology features.
For the success of the protocol, it is important to first optimize the imaging conditions, as the validity of downstream analyses is dependent on the quality of the images. While here we performed experiments using a high-content screening platform, image acquisition can also be performed using any fluorescent microscope (although an automated imaging platform is ideal for high-throughput approaches). Test images should be taken prior to each imaging time point to ensure that there are no problems with the microscope or protocol. The signal to noise ratio should be high, especially for the channels that will be used for segmentation (i.e. nuclei, cell stains). Additionally, it is important to image in the optimal plane of focus. If the images are out of focus, segmentation becomes much more difficult and the calculated morphological features will likely be inaccurate. Illumination differences between fields can cause problems with image segmentation as well. Large differences in brightness make the automated selection of threshold values difficult. Additionally, if there are heterogeneous fluorescence intensities between cells, a single threshold value may not sufficiently segment all the cells in an image. In this analysis, these problems were overcome by creating masks around brighter and dimmer cell populations and segmenting each population separately.
While the phenotypes under investigation in this protocol are limited to live, dead, and morphological characterization, they can easily be expanded to investigate other features. For example, functional genetic studies can be added with RNAi, overexpression, or other chemical perturbations.
In this paper, the capabilities of the protocol to measure the response of non-small cell lung cancer cells to erlotinib in the presence and absence of CAFs was demonstrated. However, this is merely one example of the many cell types and microenvironmental parameters that can be tested. We have extended this protocol to be used with other cell types and drug studies, including primary cells isolated from patient tumors13,15.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door National Cancer Institute (NCI) Grants U54CA143798 en U54CA143907 om respectievelijk respectievelijk Physical Sciences-Oncology Centers (PS-OC's) te vinden bij het Dana-Farber Cancer Institute en University of Southern California. SM Mumenthaler heeft een PS-OC Transnetwork Award ontvangen die een deel van dit werk ondersteunt.
We willen onze diepste dank uitspreken aan onze filantropische supporters, met name de Stephenson-familie, Emmet, Toni en Tessa, voor hun donatie van het Operetta HCS-platform. Wij danken ook J. Foo voor begeleiding en de teamleden van de Center for Applied Molecular Medicine: D. Agus voor klinische begeleiding en mentorskap, K. Patsch voor zinvolle discussies met experimenteel ontwerp, R. Rawat voor hulp in beeldanalyseprotocollen , J. Katz voor technische bijstand bij de Operetta, en P. Macklin en D. Ruderman voor nuttige discussies en feedback.
Materials
| RPMI-1640 | Corning | 10-040-CV | cell culture medium |
| FBS | Gemini | 100-106 | medium supplement |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | medium supplement |
| TC20 | Biorad | 1450102 | cell counter |
| TC20 slides with trypan blue | Biorad | 1450003 | cell counter slides |
| 96-well plates | Corning | 3904 | clear bottom black plates |
| Erlotinib | LC Laboratories | E-4007 | |
| DMSO | VWR | 317275-100ML | solution to resuspend drug |
| Hoechst | Invitrogen | H21491 | nuclear dye |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | dead cell stain |
| Cell Tracker Orange CMRA | Life Technologies | C34551 | whole cell stain |
| Operetta high content imaging system | Perkin Elmer | ||
| CellProfiler | Broad Institue | version 2.2.0 (rev 9969f42) | http://cellprofiler.org/releases/ |
| Cell culture incubator | Any cell culture incubator will be suitable – cells were cultured under 37 ºC at 5% CO2. | ||
| 15 mL Falcon conical tubes | Falcon | 14-959-53A | |
| 10 cm2 cell culture plates | TPP | 93040 |
References
- Kanemura, Y., et al. Evaluation of in vitro proliferative activity of human fetal neural stem/progenitor cells using indirect measurements of viable cells based on cellular metabolic activity. J Neurosci Res. 69 (6), 869-879 (2002).
- Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay. Cancer Res. 49 (16), 4435-4440 (1989).
- Hsu, S., et al. Green tea polyphenols induce differentiation and proliferation in epidermal keratinocytes. J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 29-34 (2003).
- Caicedo, J. C., Singh, S., Carpenter, A. E. Applications in image-based profiling of perturbations. Curr Opin Biotechnol. 39, 134-142 (2016).
- Sero, J. E., et al. Cell shape and the microenvironment regulate nuclear translocation of NF-kappaB in breast epithelial and tumor cells. Mol Syst Biol. 11 (3), 790 (2015).
- Chen, J. F., et al. Subclassification of prostate cancer circulating tumor cells by nuclear size reveals very small nuclear circulating tumor cells in patients with visceral metastases. Cancer. 121 (18), 3240-3251 (2015).
- Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. Fibroblast heterogeneity in the cancer wound. J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).
- Paraiso, K. H., Smalley, K. S. Fibroblast-mediated drug resistance in cancer. Biochem Pharmacol. 85 (8), 1033-1041 (2013).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Jones, T. R., et al. CellProfiler Analyst: data exploration and analysis software for complex image-based screens. BMC Bioinformatics. 9, 482 (2008).
- Dao, D., et al. CellProfiler Analyst: interactive data exploration, analysis and classification of large biological image sets. Bioinformatics. 32 (20), 3210-3212 (2016).
- Garvey, C. M., et al. A high-content image-based method for quantitatively studying context-dependent cell population dynamics. Sci Rep. 6, 29752 (2016).
- Juarez, E. F., et al. Quantifying differences in cell line population dynamics using CellPD. BMC Syst Biol. 10 (1), 92 (2016).
- Mumenthaler, S. M., et al. The Impact of Microenvironmental Heterogeneity on the Evolution of Drug Resistance in Cancer Cells. Cancer Inform. 14, 19-31 (2015).
